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戒毒专家—杜新忠记事 《中国禁毒工作》
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综述文献
我国神经药理学研究的主要进展
2010-10-20 22:15:01 来自:杜新忠戒毒网 作者:张均田 阅读量:1

  突触功能的可塑性(化学突触的传输效率并不是一成不变的,突触后电位的幅度会由于突触前的活动历史而增大或减小,这就是活动依赖性的突触可塑性)是学习记忆的神经基础,突触效应的长时程增强(LTP)是指用高频电脉冲对传入纤维进行短暂刺激引起该神经通路上突触传递效能明显增强,且这一效应在停止刺激后可维持较长时间,国内已建立三种类型的LTP测定技术:一是从成年哺乳动物脑区制备厚约100-700μm,能在体外存活数小时的海马薄片,其神经环路较完整,可研究原有神经环路不同神经元间的相互作用,脑片排除了血脑屏障,可在解剖镜直视下将电极插到特定部位,不需立体定位仪;二是在麻醉情况下将刺激和记录电极借助立体定位仪插入海马特定部位记录群峰电位(PS)和LTP;三是预先在大鼠脑内埋藏电极,其后,在动物清醒情况下观察不同途径给药对LTP的影响。目前,研究药物对学习记忆的影响,往往把行为试验和LTP试验结合起来,这样更有助于对药物的作用做出确切评价。

  4、细胞内钙的测定  胞内游离钙具有重要的生理功能,了解其含量和变化,具有多方面意义,无论是细胞外信号或是细胞内调节物,不论是电的,机械的或化学的刺激,凡能引起胞内Ca2+浓度的变化,那么由Ca2+介导的或依赖于钙的酶、蛋白质和有关的生理生化反应也发生改变,因此,细胞内游离钙的变化,代表着某种细胞功能启动、加强或抑制。通过提高或抑制细胞内的钙水平来观察相应生理应答反应的变化,有助于了解Ca2+对正常生理反应的调节过程。有些疾病的发生、发展往往是由于细胞内钙离子超负荷所致。测定细胞内Ca2+,可提供它与疾病间关联的直接证据。另外,胞内钙测定有助于阐明药物作用机制。

  测定细胞内游离钙含量的方法甚多,近年内荧光指示剂特别是Fura-2已得到最广泛的应用,中国医学科学院药物研究所最先在国内合成成功,并对神经元、淋巴细胞、血小板等多种细胞的测定方法进行了详细研究,举行多次学习班向全国推广。其主要优点是Fura-2与钙结合后有较大的荧光强度(比Quin-2强30倍)。它用于测定胞内钙的浓度范围介于10-4—10-10mol·L-1,包括了细胞处于静止期、激活或损伤时的钙浓度的变化。Fura-2因有较强的亲水性,难以进入细胞,在Fura-2的负性基团部位结合亲脂的乙酰羟甲基脂,成为Fura-2/AM后则极易透过细胞膜,胞浆内的酯酶将Fura-2/AM水解为Fura-2而滞留在胞浆内,后者与胞浆内游离钙结合形成Fura-2Ca2+复合物,Fura-2及其与Ca2+结合的复合物最大激发波长为380nm和340nm,其发射强度与Ca2+呈比例关系,据此可测定Ca2+浓度。

  近几年来国内采用激光扫描共聚焦显微系统和Fluo-3/AM荧光探剂标记技术观察单细胞内游离钙浓度的动态变化与分布影像,已相当成熟。主要是取清洁级孕鼠,剖腹取出胎鼠,分离皮层细胞,进行培养,于12-14天时用Fluo-3/AM负载,Fluo-3/AM在细胞内被酯酶水解成Fluo-3,Fluo-3与细胞内游离钙结合后荧光强度增强,指示[Ca2+]i的相应改变,倒置显微镜20X物镜下动态观察单细胞[Ca2+]i变化,在TimeSeries程序下开始预扫描,调节扫描参数,以取得最大电信号,最小光漂白度和最好信噪比,参数确定后动态扫描,采及格数据的间隔时间为15s,高速微机逐幅贮存观察到的动态荧光图像,并绘制细胞内Ca2+荧光强度变化曲线。

  5、仪器分析  在药理研究中的应用仪器分析已渐为药理学工作者采用,特别是高压液相色谱(HPLC)(有称为高效液相色谱法,可分析气相色谱法不易分析的高沸点物质、非挥发性性物质或热稳定性差的物质)、气相-质谱(GC-MS)和核磁共振谱(NMR)的药理学研究中的应用前景宽广。HPLC与电化学检测器联用,除可用于分析测定生物样品的NE、DA、5-HT及其代谢产物(已如上述),用此装置还可测定氧和羟基自由基,特别是对后者的测定优于ESR法。GC-MS和HPLC联用,具有高分离效率、高灵敏度和测定药物、毒物种类广泛等优点。目前对运动员禁用的“兴奋剂”包括5大类(兴奋剂、同化类固醇、利尿剂、β-受体阻断剂和麻醉药)100种药物及其代谢产物的测定,即可用GC-MS、毛细管气相色谱等检测手段来完成。NMR不但用于化学结构测定,也在生物医学中得到广泛应用。例如利用NMR观测药物与大分子(蛋白质、酶、受体)的相互作用引起双方构象或动态的变化,从谱峰的变化可反应药物代谢变化药物与分子结合的量、速度和结合方式。再如观测药物与磷脂、生物膜结构与功能关系,直接观测生物体内磷酸肌酸、ATP、糖磷和无机磷浓度,从而了解高能化合物的合成、分解过程。现已可用NMR观测的组织器官有:心脏、脑、肌肉、肝等。这一测定技术优点是,不破坏样品,不伤害生物组织,结果接近生理状态,获取信息量大,可测定生物体中所含的多种主要元素(1H、13C、15N、31P、19F、23N等),从原子、基因、分子到生物结构系统提示不同层次的相互关系。

  6、抗衰老试验  抗衰老研究是当前研究热点,衰老的成因错综复杂,选择合适的模型和方法,对于评价药物至关重要,以下是综合各方面研究工作提出的一个方案。

  动物模型:(1)老年大鼠,24-30个月。国内外研究已证明老年鼠在行为、形态和生化改变等方面均酷似早老性痴呆症(又称阿尔茨海默氏症,是老年人群中比较常见的一种疾病,患者一般先是记忆丧失,随后脑功能逐渐衰退,最终可能发展到深度痴呆而导致患者完全失去自理能力),是首选的理想模型。(2)遗传性“呆笨”小鼠,如SAMP8是一种以痴呆为主要早衰症状的品系,在8-9个月出现学习记忆能力明显下降等痴呆症状,这一品系小鼠已从日本引进,开始用于抗衰老研究。(3)基底神经核(为大脑髓质内的皮质下运动中枢)-胆碱能系统的损伤。众多证据说明,胆碱系统功能和结构的破坏与衰老关系密切,用各种方法损伤基底神经核,可作为衰老模型之一。常用以下两种方法:电灼伤和神经毒剂。

  7、分子生物学技术  国内已普遍采用分子生物学方法用于神经精神药理学研究。mRNA的提取、纯化及其分析、表达,DNA的分析和克隆,质粒的制备、克隆和扩增,基因的重组、酶切和转染至有关细胞,等等,在许多单位已较普遍应用。刘景生对外开放室构建了诱生NO合酶基因表达载体。张均田实验室建立了Baxα高基因表达的PC12细胞系和早老素-2(PS-2)高基因表达的PC12细胞系。

  8、能量代谢研究技术  在脑缺血研究中常测定ATP、磷酸肌酸的生成和乳酸、ADP、AMP等的含量来评价药物作用。线粒体是能量代谢的中心环节,也涉及到自由基(包括NO)的生成、细胞调亡。国内一些单位已建立了复合体I、II、III、IV(complexI、II、III、IV)活性、不同的呼吸态(V2、V3、V4)、线粒体膜的流动性、通透性、细胞色素C的释放等测定技术。

[责任编辑]杜新忠
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