摘要：在大鼠吗啡依赖和戒断模型上，采用行为学、免疫组织化学和Western blot方法观察吗啡依赖及戒断大鼠脊髓神经元磷酸化细胞外信号调节激酶(phospho-extracellular signal-regulated kinase, pERK)表达的变化, 及鞘内注射促分裂原活化蛋白激酶激酶 (mitogen-activated protein kinase kinase, MEK)抑制剂U0126或ERK反义寡核苷酸对吗啡依赖大鼠纳洛酮催促戒断 反应、触诱发痛及脊髓神经元pERK表达的影响，探讨脊髓水平pERK在介导吗啡依赖和戒断过程中的作用。结果显示：(1)在吗啡依赖形成过程中，大鼠脊髓胞浆与胞核非磷酸化ERK表达没有改变，但pERK表达逐渐增加，纳洛酮催促戒断后，仍有进一步增加的趋势，戒断1h后，其表达量明显下降，但仍高于对照组。(2)鞘内预先注射MEK抑制剂U0126或ERK反义寡核苷酸能明显抑制吗啡戒断反应和戒断引起的痛觉异常；与行为学结果一致，脊髓背角pERK阳性神经元表 达与脊髓胞浆和胞核pERK表达也明显降低。上述结果提示，脊髓水平ERK激活和核转位参与吗啡依赖的形成及戒断反应的表达。

　　关键词：吗啡依赖；物质戒断综合征；细胞外信号调节激酶；脊髓；痛觉异常

　　海马神经元可塑性改变是学习和记忆产生的主要机制。吗啡依赖可看作是机体神经元对药物反复 作用刺激的一种学习和记忆过程。已经证实，吗啡依赖可使相关的神经元也发生可塑性改变。Ungless 等[1]报道，单次可卡因处理可诱导离体大鼠中脑腹 侧被盖区(VTA)多巴胺神经元产生N-甲基-D -天门冬氨酸(NMDA)受体介导的长时程增强(long-term potentiation, LTP)，提示中脑边缘奖赏系统多巴胺神经元的可塑性改变参与精神依赖性的形成和发 展。近年来的研究表明，长期存在的伤害性刺激也可诱发脊髓神经元产生与海马神经元相似的可塑性 变化，如产生LTP、LTD (long-term depression)现象，结构上出现突触发芽等[2-4] 。我们以往的研究结果显示，脊髓神经元敏感化参与介导吗啡戒断反应，其产生、发展和维持机制与外周伤害性刺激引起的中枢敏感化有相似之处 [5-7]。神经元敏感化是其发生可塑性变化的具体表现之一，提示长期吗啡应 用也可导致脊髓神经元产生可塑性改变，吗啡戒断使这种可塑性得以体现。

　　敏感化的产生有赖于神经元细胞膜上受体或离子通道功能或其表达数量的增加，而上述改变又依赖于细胞内信号转导系统特别是激酶系统的激活。激活后的激酶一方面可通过磷酸化神经元膜受体或离子通道，改变神经元的兴奋性；另一方面，激活核内转录因子调节与神经元兴奋性相关的受体或离子通道靶基因表达，从而介导各种刺激引起的脊 髓神经元长时程可塑性改变，最终在细胞水平上表现为脊髓神经元的敏感化。长期应用吗啡可通过作 用于μ受体激活各种胞内信号转导系统，这已在多个水平上得到证实。

　　细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulate kinase, ERK)是MAPK家族中的一员，由其介导的胞内信号转导，在细胞分化，生长发育，神经元可塑性及多种生理病理过程中发挥重要作用。有研 究显示，由ERK介导的cAMP 反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein, CREB)磷酸化是海马神经元产生稳定的晚期相LTP和形成长期的 记忆所必须的[8-11]。同样，ERK在伤害性刺激引起 的中枢敏感化中也发挥重要作用[12-14]。因此，我们推测脊髓水平ERK信号转导通路有可能参与吗啡依赖及戒断反应过程，本实验旨在大鼠吗啡依赖及纳 洛酮催促戒断模型上采用鞘内注射ERK特异性上游激酶MEK阻滞剂U0126及ERK反义寡核苷酸，观察大鼠戒断反应及痛敏评分的变化，同时，采用免疫组织化学与Western blot方法检测磷酸化细胞外信号调节激酶(phospho-ERK, pERK)在脊髓的表达，以证实上述推测。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物及试剂　雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠，体重220～300 g，由徐州医学院实验动物中心提供。吗啡系沈阳第一制药厂产品(批号020903); 纳洛酮系Sigma公司产品；U0126为美国Bio-Mol 公司产品；非磷酸化ERK抗体、pERK抗体购于美国Santa Cruz生物技术公司。免疫组化试剂盒由北京中山生物技术公司提供。

　　1.2 反义寡核苷酸合成与硫代磷酸化修饰　ERK反义与错义寡核苷酸序列设计参照Sale 等报道[15]，寡核苷酸由上海生工生物技术有限公司合成并进行硫代磷酸化修饰，反义序列：5'GCCGCCGCCGCC-GCCAT-3'，能与ERK1和ERK2 mRNA转录起始位结合，错义序列：5'CGCGCGCTCGCGCACCC-3'。Western blot 结果显示，鞘内注射上述ERK反义寡核苷酸能有效抑制胸腰脊髓节段总ERK1/2表达，而 错义寡核苷酸对其表达没有影响(图1)。

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　　1.3 动物吗啡依赖及戒断模型建立、鞘内注射及实验分组　　雄性SD大鼠，皮下注射吗啡，首日10 mg/kg (bid)，隔日每次增加10 mg/kg，至6 d末次注射50 mg/kg，建立吗啡依赖模型。吗啡依赖大鼠末次注射吗啡后4 h腹腔注射纳洛酮4 mg/kg，建立吗啡戒断模型。为研究吗啡依赖和戒断过程中脊髓水平pERK表达变化的时间相，动物被分为正常对照组，依赖1 d组、3 d组、5 d组和戒断10 min组、30 min组、1 h组。

　　在纳洛酮激发前30 min鞘内注射U0126，反义寡核苷酸在末三次皮下注射吗啡前30 min鞘内注射。对照组分别注射人工脑脊液、U0126的溶媒DMSO和错义寡核苷酸。鞘内给药采用直接注射给 药法[16]: 取L5～6腰椎间隙，局部剪毛，2%利多卡因0.3 ml局麻后用7.5号针头破皮，使用25 祃微量注射器刺入蛛网膜下腔，出现典型鼠尾侧向甩动和抖动视为穿刺成功。所有动物药物注射总量均为 10 祃。在纳洛酮激发戒断后的1 h内根据湿狗样抖动、异常姿势、激惹症状、咬牙、植物神经系统 症状、体重降低等进行戒断症状评分。根据下述方法记录吗啡戒断致痛觉异常(allodynia)评分 [17]: 用一根玻璃棒轻轻接触大鼠肋腹部，根据大鼠对这种非伤害性轻触刺激引起的反应对吗啡戒断致痛觉异常进行评分。0分：对轻触刺激无反应；1分：轻触刺激后发出中度嘶叫并试图逃避接触；2分：轻触刺 激后发出重度嘶叫并撕咬玻璃棒。戒断后1 h内每5min评分一次。

　　吗啡依赖和戒断过程中脊髓水平pERK表达变化的时间相结果显示，pERK表达的高峰在戒断反应后10～30 min, 因此，为研究鞘内注射U0126或ERK反义寡核苷酸对吗啡戒断大鼠脊髓水平pERK表达的影 响，这部分实验的动物取材均在戒断后30 min时间点。动物被分为正常对照组、依赖组、戒断组、U0126组和反义寡核苷酸组。

　　1.4 免疫组织化学　动物在戊巴比妥钠(60 mg/kg，i.p.) 深麻醉下，经升主动脉依次灌注4℃生理盐水(100 ml)、4%多聚甲醛(400 ml, 0.1 mol/L PB，pH 7.4)。取L4～L5脊髓节段置于多聚甲醛后固定3 h后，移至30%蔗糖脱水至组织沉底。冰冻横断切片，收集在0.01 mol/L PBS中，片厚40 mm。切片经0.01 mol/L的PBS冲洗三次后，依次加入3% H2O2，30%封闭血清封闭10 min后加入小鼠抗pERK 多克隆抗体(1: 200，Santa Cruz)，4℃孵育24 h。PBS冲洗三次后，滴加生物素标记的第二抗体(羊抗鼠IgG，北京中山生物技术有限公 司提供)。37℃孵育2 h后PBS冲洗，滴加辣根酶标记链霉卵白素，37℃孵育2 h后PBS冲洗，DAB显色，贴片，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜观察，棕色染色的为阳性细胞。阴性对照实验中，用PBS代替一抗或二抗， 未见pERK样染色的神经元。

　　每只动物切取20张脊髓切片，在Olympus光学显微镜下计数两侧脊髓背角pERK阳性神经元总数，所有记数的阳性神经元均不考虑其染色深浅度。

　　1.5 免疫印迹(Western blot)方法　动物在戊巴比妥钠(60 mg/kg，.i.p.)深麻醉下急性处死，迅速取出L4～L5脊髓节段并移至液氮中， -80℃冰箱中保存待用。将脊髓组织在预冷的蛋白质抽提缓冲液 ( mmol/L: HEPES 10、Na3VO4 1、 MgCl2 1.5、KCl 10、NaF 50、 EDTA 0.1、EGTA 0.1、 phenylme-thylsulfonyl fluoride 0.5、dithiothreitol 1和0.02% protease inhibitors cocktail, pH 7.9)中匀浆，静置10 min，加入90 祃 10% NP-40后剧烈震荡30 s，4℃ 800 g离心15 min，吸取上清液，即为细胞浆成分。将沉淀用冰冷的核蛋白抽提缓冲液(mmol/L: HEPES 20、NaCl 420、MgCl2 1.5、 edetic acid 1、egtazicacid 1、dithiothreitol 1、phenylmethylsulfonyl fluoride 0.5，glycerol 20 %和 0.02% protease inhibitors cocktail, pH 7.9) 重悬，4℃ 震摇孵育30 min，4℃ 13 000 g离心15 min，取上清为胞核蛋白。根据Bradford法测定样本蛋白浓度后加入4倍样本缓 冲液(250 mmol/L Tris-HCl, pH 6.8, 其中包括0.01% Coomassie brilliant blue-G，8% sodium dodecyl sulfate, 200 mmol/L sucrose, 和 300 mmol/L dithiothreitol)，95 ℃水浴5 min。取等量样本加至10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶恒压电泳，压缩胶80 V，分离胶150 V。湿法将蛋白转移至硝酸纤维素膜。3%牛血清封闭3 h后加小鼠抗pERK多克隆抗体(1: 3 000) 4℃孵育过夜；TBST冲洗，3×15 min，加入碱性磷酸酶标记的马抗小鼠二抗(1:10 000)，室温摇床孵育1.5 h，TBST冲洗3×15 min，加入显色剂(NBT/BCIP)，待反应达到要求后，流 水洗涤终止反应。所得条带经Adobe公司Photoshop软件半定量分析处理。

　　1.6 统计学分析　采用Excel软件对实验数据进 行统计分析，并生成统计图。所有数据均用mean±SD表示。两组间比较用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05认为有显著性差异。

　　2　结果

　　2.1 吗啡依赖及戒断过程中非磷酸化ERK、pERK表达的变化

　　Western blot结果显示，与正常组大鼠相比，吗啡依赖及戒断过程中脊髓胞浆及胞核非磷酸化ERK 无明显变化(P>0.05)。吗啡依赖形成过程中，大鼠脊髓胞浆与胞核pERK表达逐渐增加，纳洛酮催促戒断后，仍有进一步增加的趋势，戒断后10～30 min为其表达高峰，戒断1 h后，其表达量明显下降，但仍高于对照组(图2)。

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　　2.2 鞘内注射U0126和ERK反义寡核苷酸对吗啡戒断症状和TEA评分的影响

　　在纳洛酮激发戒断前30 min鞘内注射U0126或依赖第5 d起鞘内注射ERK反义寡核苷酸，能明显减轻吗啡戒断症状和TEA评分( P<0.05)，而鞘内注射U0126的溶媒DMSO和错义寡核苷酸对戒断症状无明显影响(P>0.05)(图3)。

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　　2.3 鞘内注射U0126和ERK反义寡核苷酸对吗啡戒断大鼠脊髓水平pERK表达的影响

　　免疫组织化学结果显示，吗啡依赖大鼠双侧脊髓背角pERK表达数目较正常大鼠明显增加，戒断30 min组同依赖组相比无显著差别。鞘内预先注射U0126或ERK反义寡核苷酸能明显降低吗啡戒断大 鼠脊髓背角pERK表达(P<0.05)(图4); 鞘内预先注射U0126或ERK反义寡核苷酸也能明显降低吗啡戒断 大鼠脊髓胞浆及胞核pERK表达(P<0.05)(图5)。鞘内注射DMSO和错义寡核苷酸对其表达则无明显影 响(P>0.05)(数据未显示)。

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　　3　讨论

　　3.1 ERK激活参与吗啡依赖和戒断状态下脊髓神经元敏感化

　　传统观点认为，蓝斑核是介导吗啡戒断反应的主要部位，但大量研究表明，作为联系外周神经和 高位中枢纽带的脊髓在吗啡戒断反应中发挥重要作用 [18-20]。脊髓化或背根切断或鞘内注射某些药物可 明显减轻大鼠吗啡戒断症状[21,22]。Miyamoto等 [23]证实，吗啡依赖大鼠鞘内注射纳洛酮催促戒断反应所需的剂量较脑室内注射剂量小18～20倍，提示脊髓在介导吗啡戒断反应中发挥重要的作用。临床上，胃肠绞痛，肌肉关节疼痛，痛觉过敏，肌强直，心动过速，血压增高等多种戒断症状也可通过脊髓水平介导。因此，研究脊髓在吗啡躯体依赖性中的作用有重要的理论和实践意义。

　　以往的实验已经证实，长期应用吗啡导致脊髓神经元处于潜在敏感化(latent sensitization)，伤害性刺激和纳洛酮催促戒断使这种潜在敏感化得以呈现，表现为强烈的敏感化状态，行为上表现为吗啡镇痛耐受和戒断反应 [5-7,24,25]。 因此, 神经元敏感化是吗啡镇痛耐受的产生和戒断反应表达的细胞学基 础。研究表明，多种受体及细胞内信号通路均参与介导吗啡依赖和戒断脊髓神经元敏感化过程，如 NMDA受体、cAMP/PKA、PKC及NO等。本实验结果显示：(1)吗啡依赖形成过程中，大鼠脊髓 胞浆与胞核pERK表达逐渐增加，纳洛酮催促戒断后，有进一步增加的趋势，戒断1 h后，其表达量明显下降，但仍高于对照组。(2)鞘内预先注射 MEK信号通路抑制剂U0126或ERK反义寡核苷酸能明显抑制吗啡戒断发应和纳洛酮催促戒断引起的痛 觉过敏，与行为学结果一致，脊髓背角pERK阳性神经元表达与脊髓胞浆和胞核pERK表达也明显降低。提示，脊髓水平ERK激活和核转位参与介导吗啡依赖的形成及戒断反应的表达。

　　离体实验证实, 激活μ受体可调节pERK的表达。在表达有μ受体的中国仓鼠卵细胞和HEK 293细胞上应用吗啡可激活ERK并引起其核转位[26-28] ; 在稳定表达μ和δ受体的C6胶质瘤细胞和人淋巴细胞上也得到类似的结果 [29,30]。在体急性或慢性应用吗啡或吗啡戒断也可引起多个脑区神经元ERK信号通 路的激活。Narita等报道，单次皮下注射吗啡即可使脑桥神经元pERK表达增加， μ受体拮抗剂纳洛酮则可阻断这种效应[31]; 慢性应用吗啡可引起与精神依赖相关的VTA及与戒断反应相关的蓝斑核、孤束 核和下丘脑等部位pERK表达增加[32-34]。脑室内应用MEK抑制剂能明显减轻吗啡引起的条件位置偏爱[35]。不仅如此，其他依赖性药物或非依赖性也可激活ERK信号通路。Valjent等用CD-1小鼠试验证实，可卡因、THC、尼古丁、咖啡因、东莨菪碱、抗抑郁剂和安定等药物均可激活伏隔核、杏仁核中心、额叶皮质深层等脑内特定区域ERK[36]。Sanna 等的实验结果表明，乙醇慢性作用则可抑制脑内大 部分区域的ERK的激活，在戒断期间，脑内大部分区域pERK表达增加，最显著的部位是杏仁核、小脑、纹状体和海马[37]。药物引起的ERK激活在 其急性或慢性效应中发挥重要作用。

　　3.2 吗啡依赖和戒断状态下脊髓水平ERK激活的可能机制

　　吗啡作用于与G蛋白耦联的μ受体后，通过多种胞膜和胞内信号转导机制激活ERK：(1)阿片受体 激活Gi/o蛋白，使Gβγ亚单位释放出来，继而Gβγ亚单位以ras依赖形式激活ERK；(2)μ受体激活后通过胞内激酶系统之间的相互作用(cross talk)进一步激活ERK，如 cAMP/PKA、PKC、CaMKⅡ及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)等 [38-40]; (3)多种胞膜上的递质/受体系统也参与阿片受体对ERK表达的调节，如 Glu/NMDAR、Glu/mGluR、BDNF/Trk等[41,42] ；(4) 阿片受体通过与酪氨酸激酶受体如表皮增长因子受体(EGF)之间的相互作用，引起酪氨酸激酶受体自 身磷酸化，进而募集ERK，使其激活[43]。 最近Kawasaki等在炎症痛模型上证实，NMDAR、AMPAR、mGluR、PKA、PKB、PKC、CaMKⅡ 和酪氨酸激酶Src均通过激活ERK介导外周伤害性刺激引起的脊髓背角神经元敏感化和行为痛过敏 [44]; Zhuang等研究表明，由PI3K和PKB介导的背根神经节ERK激活参与外周炎性刺激引起的热痛觉过敏[45] 。Pezet等研究结果显示，外源性BDNF可迅速激活脊髓水平ERK，利用TrkB-IgG融合分子封 闭BDNF的作用，可明显减轻伤害性刺激引起的脊髓神经元ERK的激活 [46] 。因此，有理由推测吗啡依赖和戒断状态下通过上述机制引起脊髓水平ERK激活。

　　3.3 ERK激活后参与吗啡依赖和戒断状态下脊髓神经元敏感化的可能机制

　　激活后的ERK可通过多种机制参与吗啡依赖和戒断状态下脊髓神经元敏感化过程。(1)pERK直接磷 酸化细胞膜上的离子通道或受体，从而改变细胞膜的兴奋性。有研究表明，A型K +通道Kv4.2是pERK重要的磷酸化靶点; Hu等发现背角神经元A型K+电流与神经元兴奋性密切相关，且pERK对其有整合作用[47,48]，这种作用可能与伤害性刺激引起的中枢 敏感化有关。(2)激活后的ERK转位至胞核磷酸化相应的转录因子如CREB，pCREB进而调节c-fos基因表达，Fos蛋白生成后转位到核内与另一个即早基因c-jun的产物Jun形成异源二聚体，即AP-1。AP-1与靶基因顺式作用元件序列结合后，调控吗啡作用引起的靶基因的表达，从而介导药物引起的神经 元长时程改变。ERK通过磷酸化CREB参与神经元长时程可塑性变化已在多种模型上得到证实。同样，ERK介导的CREB磷酸化在伤害性刺激引起的脊髓神经元敏感化中也发挥重要作用 [44]。Ma等在离体和在体实验中均已证实，ERK介导长期应用吗啡引起的背根神经节pCREB表达增加[49]。因此，有理由认为ERK激活后通过上述机制参与吗啡依赖和戒断状态下脊髓神经元的敏感化。

　　本实验虽在脊髓水平证明了ERK信号通路参与了吗啡依赖和戒断过程，但要阐明其具体机制，还需从信号通路的上下游着手，作进一步深入的研究。

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