吗啡等阿片类物质，主要通过作用于大脑中的μ－阿片受体，影响中枢和周围神经系统而发挥镇痛等生物学效应。阿片受体属于G－蛋白偶联受体超家族（GPCRs）的成员之一，具有7个跨膜螺旋片段，它主要依靠抑制性G－蛋白的介导调控细胞内第二信使系统而发挥其作用。

    当持续给予吗啡处理时，常常会产生吗啡镇痛作用的耐受。在细胞水平，吗啡耐受被认为是持续药物处理后，神经元膜上的阿片受体处于持续脱敏状态，从而影响跨膜信号转导的多个环节。近年来，持续暴露于吗啡的神经元的许多功能改变已经引起人们的广泛注意。持续吗啡暴露后发生μ－受体的下调，μ－受体结合位点结合学说在受体调节机制中占有重要地位。吗啡耐受过程中，除了μ－受体数量改变外，阿片受体信号转导通路组成成分的改变也成为人们日益关注的焦点，这些改变包括腺苷酸环化酶(AC)的兴奋性增加、G－蛋白亚基水平的改变。在吗啡耐受过程中，蛋白激酶A/C(PKA/PKC)和β肾上腺素能受体激酶(βARK)等激酶活性的改变亦引起重视。

    本文将就吗啡依赖过程中的阿片受体跨膜信号转导机制的研究进展作一简要综述，借以阐述吗啡依赖的细胞水平机制。

    一、μ－受体的配体结合位点的组氨酸残基的作用

    μ－受体cDNA编码的氨基酸序列是具有7个跨膜片段的G－蛋白偶联的受体。其中3个位于受体跨膜区域并决定生理pH值的氨基酸残基，是G－蛋白偶联受体识别配体并转导信号的关键部位。它们位于相对低脂的中心部位。尽管第二跨膜区域的天冬氨酸是G－蛋白偶联受体中相对稳定的残基，第三跨膜区域的天冬氨酸参与结合胺类配体的过程[1]，但这些残基，同位于第六跨膜区域(TM6)的组氨酸残基(His297)一样，对于激动剂识别并结合μ－受体来说是至关重要的[1]。

    Spivak等人[2]的研究不仅发现TM6的组氨酸侧链是受体与阿片类物质结合的关键位点，而且第六跨膜区与细胞内第三环组成的统一整体，在G－蛋白与GPCRs相互作用的过程中，也起到重要作用。为了解释TM6的组氨酸咪唑侧链在受体识别中的作用，Spivak等人通过测定该位置的8种点突变体的亲和力[2]，还发现仅谷酰胺(His297Q)和天冬氨酸(His297N)突变体有与μ－受体选择性激动剂[3H]DAMGO较弱的结合作用，而其他突变体则完全没有结合活性。并认为，尽管组氨酸侧链不是产生效应的唯一组分，但是该部位残基侧链的长度和活性氢键的电位对于受体的结合功能是至关重要的。焦磷酸二乙酯(DEPC)是一种能在pH=6的酸性环境下选择性识别组氨酸残基的配体，它可以显著减弱[3H]DAMGO的结合能力，而对于相对缺乏His297的突变体却无明显的作用。而且[3H]纳洛酮的结合能力也可被DEPC减弱。因此，可以推测，组氨酸可能位于阿片结合位点附近或其内部。

    阿片受体拮抗剂纳洛酮，可作为突变型受体的部分激动剂，介导G－蛋白偶联的突变型受体的活化,使G－蛋白偶联的K＋通道开放[2]。由于从纳洛酮到纳曲酮，到丁丙诺啡，其结构活性的改变，致使突变型受体的活性逐步增加[2]。而相同配体对于未突变的μ－受体却不能发挥作用，因此，可以推测，位于μ－受体结合位点的特异性氨基酸，即TM6的His297,对于维持受体识别位点的正常结构具有重要作用，而且TM6与细胞内第三环直接连接在一起所构成的区域，在μ－受体结合G－蛋白的过程中，发挥着重要作用。如果His297部位发生点突变，那么识别位点将受到影响，G－蛋白结合位点的构象亦可能发生改变，从而影响配体的作用发挥，致使纳洛酮由拮抗剂转变为激动剂。

    二、μ－受体的下调和受体磷酸化在吗啡依赖过程中的作用

    Bernstein等人[3]用Westernblot发现，慢性吗啡处理后，μ－受体的数量减少50％，认为中枢神经系统许多脑区的受体数量的减少可能是吗啡依赖的机制之一，在这些脑区μ－受体的下调，可能是长时间作用后神经元对吗啡产生低反应性的重要原因。

    阿片受体数量的减少可能是耐受发展的早期原因。Patrick等人发现[4],慢性吗啡处理后，细胞耐受的首次发作出现在处理后的24－48h，其可能机制是由于受体内吞致使膜表面的阿片受体数量减少所致。除了受体数量的下降外，通过对吗啡耐受大鼠的大脑组织中分离的μ－受体的测定，还发现PKA介导的受体磷酸化作用明显减弱；与此相反，急性吗啡处理后，PKA介导的受体磷酸化作用会有一个短暂的增强[3]。研究表明，吗啡可能优先结合磷酸化的受体，或者受体的磷酸化作用使之与G－蛋白的偶联更有效[5]。假如此研究是正确的，那么，在吗啡处理的开始阶段，吗啡镇痛作用和大脑内吗啡含量达到峰值，以及PKA介导的受体磷酸化作用的增强是合乎逻辑的。而在持续吗啡处理后，由于被活化的μ－受体发挥生物学效应，导致AC的抑制以及PKA活性的下降，PKA介导的受体磷酸化作用便明显减弱，从而使μ－受体恢复到先前的、无反应的、去磷酸化状态。这种负反馈抑制作用可能最终导致受体脱敏，使慢性吗啡处理后大鼠对吗啡耐受。因此，PKA介导的受体磷酸化作用的减弱可能在吗啡耐受过程中发挥重要作用。

    急性吗啡处理后，μ－受体的磷酸化增加，而在慢性吗啡处理后却减少；阿片急性处理抑制PKA活性，慢性处理则增强PKA活性[3]。这一现象的可能解释是在急性吗啡处理时，激动剂的作用可能致使μ－受体发生顺应性改变，暴露受体上的激酶结合位点，PKA与μ－受体结合，使受体磷酸化程度升高；由于PKA与μ－受体的激酶结合位点持续不断的作用，使得在慢性吗啡处理后，这些位点的反应性减弱，与PKA结合的能力下降，磷酸化的μ－受体便相应减少。

    因此，在吗啡耐受过程中，μ－受体的自身数量减少，处于磷酸化状态能转导信号的μ－受体亦减少，而且，两种机制在吗啡耐受过程中都起到极其重要的作用。

    三、吗啡依赖过程中信号转导通路的变化

    μ－受体是G－蛋白偶联受体超家族成员之一，近年来，对μ－受体介导的吗啡效能的细胞机制研究有了很大突破。尽管受体的行为和药理性能已有了广泛的研究，其信号转导的研究仍主要集中于对G－蛋白偶联的环磷酸腺苷（cAMP）第二信使系统的调控方面。阿片类物质通过受体与Gi/Go－蛋白的结合发挥作用抑制AC，此过程主要通过G－蛋白的Gα亚基介导。

   1、 Gi/Go－蛋白的失活可减弱阿片类激动剂的效能

    阿片受体是G－蛋白偶联受体超家族成员，该家族通过G－蛋白介导抑制AC的活性，另外，该家族的一些成员可以通过对Gi/Goα介导的K＋通道的活化或者是对电控Ca2＋通道的抑制而抑制神经元活动。因此，Gi/Go－蛋白可能参与阿片信号转导过程[6]。

    百日咳毒素（PTX）可以作为研究抑制型G－蛋白活动的工具剂。PTX可以阻断中枢性阿片受体介导的电生理活动以及对AC的抑制作用，而且Giα/Goα亚基是脑组织中PTX唯一的底物。PTX可以促进伏隔核二磷酸腺苷（ADP）结合型Gi/Go－蛋白的解离，从而使功能性Gi/Go－蛋白的数量下降[6]，这样，功能性Gi/Go－蛋白的减少便可导致阿片类物质依赖的加剧。PTX引起的功能性Gi/Go－蛋白的减少可能通过初始的G－蛋白失活和后期的G－蛋白表达水平的下降两个机制来完成的。尽管PTX引起的功能性Gi/Go－蛋白下降机制仍需进一步研究，但不容置疑的是，Gi/Go－蛋白的失活可以减弱阿片类激动剂的效能，产生药物依赖。

    2、兴奋性增高的腺苷酸环化酶信号转导系统在吗啡依赖中的作用

    吗啡依赖的现象之一是cAMP第二信使系统功能活动的增加，即AC活性的增加。阿片受体的急性激活导致AC的抑制，使细胞内的cAMP水平下降。然而，在慢性吗啡处理的过程中，初始下降的cAMP水平开始上升，甚至超过了先前的水平[7]。AC活性的增加，即AC 的超敏，是由兴奋性G－蛋白偶联的受体系统的正反馈调控机制介导的，一些特异性调控改变已得到证实，包括兴奋性G－蛋白偶联受体和G－蛋白数量的改变，以及两者偶联能力的增强[7]。然而，在AC超敏的某些细胞中，兴奋性信号转导复合物的数量并没有明显的改变[8]，因此，除兴奋性G－蛋白偶联受体系统的正反馈调控外，可能存在其它机制的调控参与吗啡依赖。

    AC的激活可以由活化的三磷酸鸟苷（GTP）结合状态的Gsα介导。作为多种信号转导蛋白的一种，Gsα亚基可在氨基末端附近发生翻译后的棕榈酰化。受体活化后，Gsα的棕榈酰化可以迅速地逆转，因此，Gsα的棕榈酰化可能控制信号转导的进程。事实正是如此，Gsα的棕榈酰化对于信号转导系统的完整性是必需的，而且，还参与控制蛋白质的亚细胞水平的定位[9]。

    为了研究Gsα的棕榈酰化在细胞内信号转导过程中的作用，Ammer等人[10]制备了一种细胞模型Ac31/μ13。对Ac31/μ13细胞克隆进行慢性吗啡处理后，可以显著增加AC信号转导的能力，而兴奋性G－蛋白和AC的数量却没有明显的改变[8]，这样，Ac31/μ13细胞便可以作为研究兴奋性AC信号转导的极佳模型系统。研究[10]发现，（1）慢性吗啡处理可以增强Gsα的兴奋性；(2)Gsα的棕榈酰化可以减弱Gsα的兴奋性，从而减弱Gsα活化AC的能力；（3）慢性吗啡处理可以减少Gsα的棕榈酰化状态。吗啡依赖过程中，Gsα棕榈酰化状态的减少可以增加兴奋性G－蛋白偶联受体系统的功能活动，而且兴奋性G－蛋白偶联受体的激活可以加速Gsα棕榈酰化的逆转过程，因此，吗啡依赖过程中，兴奋性G－蛋白偶联受体的激活可以负反馈调控Gsα的棕榈酰化；（4）去棕榈酰化可以增强Gsα/AC的相互作用。去棕榈酰化的Gsα与AC的结合作用的增强原因，可能是由于游离Gβγ亚基可影响AC的活性，或者是由于去棕榈酰化可以增强Gsα的移动度，使之更易接近AC。

    因此，慢性吗啡处理介导的Gsα去棕榈酰化可以增强Gsα的兴奋性，并能增强Gsα与AC的结合作用，这一调控机制可能参与AC超敏过程。不容置疑的是，去棕榈酰化的Gsα的功能活动可以调控AC的活性，并且Gsα/AC复合体可能参与吗啡依赖过程中腺苷酸环化酶信号转导系统兴奋性的调控。

    四、Gβγ亚基在μ－受体激活的信号转导中的作用

    阿片类激动剂与受体发生作用后，致使G－蛋白偶联的信号转导通路发生效应，GTP结合的Gα亚基与Gβγ亚基分离。研究表明，游离Gβγ亚基可以作为许多不同效应器转导通路的独立活化因子[11]，这些通路需要磷酸肌醇激酶－3（PI3K）作为信号级联的早期重要环节。PI3K早先被认为是一种磷酯酰肌醇激酶，参与酪氨酸磷酸化过程以及受体酪氨酸激酶信号转导过程。近年的研究发现，PI3K能特异性地被Gβγ亚基激活，成为被有丝分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）信号转导通路中关键的环节[12]。

    3种PI3K下游作用因子，丝氨酸/组氨酸激酶Akt（即蛋白激酶B）、p70s6激酶，和蛋白合成因子4E（eIF－4E）的抑制因子（4E－BP1和4E－BP2），可被G－蛋白偶联受体激活。Akt的活化可导致细胞生存、葡萄糖摄取和糖原代谢的改变[13]。p70s6激酶可磷酸化40s亚基核糖体蛋白s6，并参与mRNA转录体的翻译调控，在5'端产生一个多嘧啶束[14]。4E－BP1/2可以抑制始动因子eIF－4E，在翻译调控中起关键作用，影响蛋白合成[15]。

    μ－受体的兴奋可导致Akt和p70s6激酶活化，4E－BP1失活，此与这些蛋白的磷酸化的明显增高有关。μ－受体激动剂引起的Akt、p70s6和4E－BP1磷酸化过程可被纳洛酮所拮抗。因而，μ－受体可特异性地激活G－蛋白偶联和PI3K依赖的有丝分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）信号转导通路。

    由于Akt参与神经元的生存过程，因此μ－受体介导的MAPK信号转导通路可能参与阻止特异性发育神经元凋亡的过程。这一假说有足够的说服力：吗啡和内源性阿片肽可抑制神经细胞的凋亡[16]。另外，参与细胞增殖的信号级联在有丝分裂后的神经元中不应该有促有丝分裂的功能，但是，MAPK通路却参与了海马长时程记忆过程[17]，更重要的是，阿片可作为海马可塑性的介质，而这一过程却需要局部蛋白质的合成。那么，此现象可能的解释便是，海马区μ－受体的激活导致p70s6和4E－BP1介导的蛋白合成调控机制发挥效应，才使神经元的可塑性成为可能。

    因此，μ－受体通过激活MAPK信号转导通路，参与神经元生存和翻译调控。这两个过程在神经元发育、抑制凋亡、长时程记忆和突触可塑性等过程中起到重要的作用。

    五、吗啡依赖的蓝斑内βARK活性水平发生改变

    βARK是一种组氨酸/苏氨酸蛋白激酶，存在于胞浆内。许多G－蛋白偶联受体被激活而发生构象改变，并成为βARK的底物。在受体磷酸化过程中，βARK也会出现在细胞膜并短暂停留，Gβγ亚基介导了βARK向膜运动的过程。βARK介导的特异性组氨酸残基磷酸化可以增加受体和配体的亲和力。β－受体阻滞剂与G－蛋白对受体的竞争结合作用，可能与受体脱敏有关，阿片受体作为G－蛋白偶联受体的一种，也可以受到βARK和β－受体阻滞剂的调控。

    βARK有两种亚型，βARK1和βARK2，它们广泛存在于大脑中，βARK属于G－蛋白偶联受体激酶（GRKs）家族，GRKs家族可能介导某些特异性G－蛋白偶联受体的磷酸化过程。β－受体阻滞剂亦有两种亚型。

    慢性吗啡处理后，蓝斑区的βARK1活性水平增强，而βARK2的活性在许多脑区（包括蓝斑）都没有改变[18]。伴行给予纳洛酮，可以完全阻断慢性吗啡处理增强βARK1活性的能力，而单独给予纳洛酮却不能影响βARK1活性。与慢性处理相反，急性吗啡处理不能影响βARK1活性，因此，吗啡βARK1的调控需要阿片受体的长时程活化。慢性吗啡处理后，蓝斑区β－受体阻滞剂活性也有所增强[18]，但中枢其它部位如海马、腹侧顶盖区或额叶皮层的β－受体阻滞剂没有改变。蓝斑区β－受体阻滞剂的增加同样可被纳洛酮的伴行处理阻断。

    在电生理学研究的基础上亦发现，蓝斑区βARK1和β－受体阻滞剂水平的增加可能参与阿片受体耐受过程[19]。在阿片受体数量持续不变的情况下，高水平的βARK1可导致受体磷酸化，致使阿片受体激动剂暴露。受体较高的磷酸化以及受体与高水平的β－受体阻滞剂的相互作用可以使受体对阿片类物质的生理反应减弱。

    综上所述，μ－受体作为G－蛋白偶联受体超家族的成员，它主要依靠抑制性G－蛋白的介导控制细胞内第二信使系统而发挥其作用。在细胞水平，吗啡耐受可以被认为是持续药物处理后阿片受体的持续脱敏状态，从而影响跨膜信号转导的多个环节，并引起一系列细胞内信号转导通路的改变，包括Gsα亚基介导的腺苷酸环化酶信号转导系统、Gβγ亚基介导的MAPK信号转导系统、βARK1和β－受体阻滞剂表达水平的调控以及μ－受体自身数量和磷酸化过程的调节等机制的改变，而影响细胞的生物学功能，产生一系列的耐受效应。

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