一、阿片受体μ、δ、κ三种类型均克隆成功
1992年美国加州大学洛杉矶分校Evans等[1]首先在Science报道了δ受体克隆成功。他以仅含δ受体的NG108-15杂交瘤细胞为材料，采用“功能表达克隆法”， δ受体克隆成功。阐明了δ受体的一级结构，证明具有典型的G蛋白偶联受体的特性，有七次跨膜疏水区段，由372个氨基酸组成，N末端有两个糖基化位点。将δ受体cDNA转染到COS细胞，以受体结合试验证明对δ受体选择性配体DPDPE结合有高亲和力，而对κ、μ受体的配体亲和力都很低。同时还证明可由激动剂作用使cAMP量减少，由于腺苷环化酶活性受抑制之故。几乎在同时法国的Kieffer等在PNAS上也发表克隆δ受体成功，方法路线也完全相同。这一成果影响极大，很快对μ、κ受体的克隆相继获得成功。1993年我国留美学者于雷（Yu Lei）{2}发表μ受体克隆成功。他采用的方法是“低严谨杂交法”，大鼠脑为材料，证明μ受体蛋白也具七次跨膜特征，由389个氨基酸组成，在N末端有5个糖基化位点，认为在第二及第三跨膜区段有门冬氨酸残基，可能是与配体的结合位点。在膜内环Ⅱ和内环Ⅲ以及C-末端有一些磷酸化位点。将克隆的μ受体c-DNA转染到COS细胞，证明对DAGO（μ配体）的结合亲和力有高选择性，而对δ、κ受体亲和力较低。证明确为μ受体，也证明其抑制腺苷酸环化酶的特性，是G蛋白偶联受体之一。以后，孟帆等对κ受体的克隆也在1993年获得成功[3]。同样，κ受体蛋白具有与G蛋白偶联的共性，由380个氨基酸组成，有七次跨膜特性等。阿片受体三种类型μ、δ、κ均克隆成功，一级结构都得到阐明。为阿片受体结构功能研究打下了坚实的基础。
对三种阿片受体类型克隆成功，一级结构得到阐明，为研究阿片受体选择性配体与受体结合部位提供了重要基础。许多实验室开展了这一方面的研究。日本京都大学的Masamichi Satoh实验室（1995）[4]对μ受体选择性激动剂DAGO结合部位有较系统的研究。他们采用嵌合受体方法（chimeric receptor）将μ受体及δ受体结构为基础制备多个嵌合受体，分析μ受体与DAGO等激动剂结合部位。结果说明围绕第一膜外环的结构包括EL-1、TM-2及部分TM-3是DAGO的结合部位。但其他肽类激动剂如morphiceptin、CTOP、dermorphin特异性己较弱。而吗啡等非肽类激动剂及拮抗剂naloxone则不同。说明这一特定部位仅对DAGO有重大意义。可见不同的配体其结合部位并不一定相同。孟帆等（1995）[5]也采用嵌合受体方法，接部分δ受体结构于κ受体结构上，获得多个嵌合受体，研究了κ-选择性配体与这些嵌合体结合差异，结果说明对κ选择性配体的结合部位主要在κ受体的TM1-4跨膜区段及EC-2部位，而对δ受体选择性配体的结合部位主要在δ受体TM5-7部位，而N末端也可能有重要意义。刘陈丽支等（1996）[6]采用μ/δ嵌合受体研究了δ受体的配体superfit的结合部位，发现从δ受体结构中第一胞内环至TM-3间的一段可能是superfit与δ受体结合的主要部位。这一方面研究极多，总的看来，不同结构的配体，包括激动剂及拮抗剂与相应受体结合部位不同。存在较复杂的情况，有待深入细致的研究。但这些结果为采用点突变技术明确单个氨基酸残基结合位点十分重要。
采用点突变技术研究结合位点工作已在展开。Kong等（1993）[7]，Surart等（1994）[8]曾根据一般G蛋白偶联受体结合位点研究结果启示，可能在TM-2上的aspartate残基有重要意义，他们将δ受体上TM-2中Asp-95改为asparagine或在μ受体Asp-114改为asparagine，glutamic acid，或alanine均可大大下降与配体的结合亲和力。他们还对μ受体上TM-3 Asp147及 TM-6 His-297点突变为 alanine，可见结合亲和力下降。这些工作有一定意义，但这些结果是由于直接与这些氨基酸残基结合的关系，不是间接的结果尚待研究。
由于三类受体，根据功能研究药理学分析均存在多种亚型，如μ1、μ2、κ1、κ2、δ1、δ2 等等。但对这些亚型结构尚未搞清，是否存在不同的结构差异，或是结构相同，仅在不同环境下，功能各异。这是一个大家关注的问题。另对受体蛋白的三级结构研究有待阐明，因为只有阐明了三级结构才有可能彻底搞清结构与功能的关系，这需要各种专业协同攻关方能解决。膜蛋白结构研究难度很大，需要在方法上有新的突破，希望在21世纪初能取得成功。
二、阿片孤儿受体ORL-1（Orphan Receptor）及内源性配体（Orphanin FQ ，nociceptin，孤啡肽）内源性拮抗剂Nocistatin的发现
1994年相继在几个不同实验室发现了一种与阿片受体结构类似但功能特性不同的受体叫阿片孤儿受体（ORL-1）[9]。在人由370个氨基酸组成，在大鼠为367个氨基酸，均有七次跨膜疏水区段，N末端有三个糖基化位点，在胞外环上有两个半胱氨酸残基互联使结构稳定，在胞内环上有磷酸化位点。在人孤儿受体上第二第三跨膜区有门冬氨酸，可能是与配体结合位点。将受体转染到CHO或COS细胞上，受体结合实验证明μ、δ、κ选择性配体的亲和力均甚低，证明为特殊功能的受体。因此内源性配体的寻找便成了研究的焦点。
发现孤儿受体后一年，1995年法国的Meunier等[10]及美国的Reinscheid等分别在Nature及Science上发表称已找到孤儿受体的内源性配体，Meunier叫它为nociceptin，而Reinscheid叫它为orphanin FQ ，中国学者有人译为孤啡肽，是从猴及大鼠脑中分离得到的。这是一个十七肽（FGGFTGARKSARKLANQ），其结构与强啡肽A极似，其N端四个残基（Phe-Gly-Phe）对其活性十分重要。随之的九个残基有增加活性的作用。虽然其结构与一些内阿片肽有其同之处，但这孤啡肽不能与阿片受体有高亲和力，也具有抑制腺苷酸环化酶的作用。孤啡肽功能研究证明，脑室注射对阿片孤儿受体的反义寡核苷酸可以阻断OFQ受体的作，Reinscheid在小鼠热板法测痛，OFQ可使痛阈大大下降。Nociceptin与阿片肽的痛觉机制作用相反，阿片肽有镇痛作用，而nociceptin却使痛下降，可增加痛觉的敏感性（hyperalgesia）及allodynia作用（异常疼痛，指正常皮肤对非伤害性刺激产生的痛觉）。这可在脑室或鞘内给药产生。它还可使ORL-1转染的细胞中腺苷酸环化酶活力受到抑制，还可增加大鼠体外背缝神经元（dorsal raphe neurone）K+电导，可抑制在人神经母细胞电压依赖Ca2+通道的电流。原位杂交及免疫组化实验证明在中枢神经系统许多区域均有分布，除上述nociceptin功能外，其生理功能尚待深入研究。采用nociceptin受体基因敲出小鼠的制备是一个研究整体动物功能的好方法，另如有nociceptin拮抗剂的出现，对研究其功能十分重要。
1997年INRC会上有人报道脑室注射OFQ有利尿作用，希望能开发新药。由于分子药理学的发展，已发现了不少体内内源性活性物质受体的孤儿受体，从中研究出新的内源性配体，这对新药研究开辟了一条重要途径。
1998年Okuda-Ashitaka等日本学者在Nature发表文章[11]同时在INRC-1998会上宣布她们已找到nociceptin的内源性拮抗剂nocisatin（bPNP-3）与nociceptin一样也是一个十七肽，均来自同一前体，其结构 在牛脑分的bPNP-3为TEPGLEEVGEIEQKQLQ，它在前体的位置正好接在nociceptin十七肽之后。在人、牛、小鼠、大鼠的结构有差别，但都具有最后的EQKQLQ六肽是保守的。对nociceptin的吗啡抑制作用以牛脑分得的bPNP-3最强，ID50为0.715pg，其末尾的八肽氨基酸残基作用最强，ID50达0.125pg。在所有不同来源nociceptin均有一个共同的保守肽段EQKQLQ也有阻断nociceptin的作用。故认为nocisatin为内源性nociceptin的拮抗剂。对其功能研究已引起广泛关注。
三、阿片受体基因敲出（Knock Out）小鼠制备成功
这一成就使在整体动物上对μ阿片受体在镇痛及依赖性作用机制上的意义得到证明。这一研究还为填平试管中分子生物学研究获得的结果和整体动物上功能表达的关系铺平道路。受体基因敲出技术的应用使μ受体在镇痛及机体依赖等分子机制中作用提供了一条重要途径。法国Kieffer实验室的Matthes等[12]在1996年Nature上发表了以胚胎干细胞基因敲出技术，建立了一株缺失μ阿片受体基因的小鼠。这种小鼠除了缺失μ受体基因外，一切行为、特性均正常，仍保留δ、κ选受体基因。取脑膜制备进行受体结合试验，证明μ受体选择性配体[3H]DAGO结合受体的亲和力丧失，而对δ及κ选择性配体的受体结合亲和力仍保持不变。证明这种μ受体基因敲出小鼠制备是成功的。对这种小鼠进行了吗啡镇痛作用观察，这种缺失μ受体基因小鼠对吗啡不再产生镇痛作用（热板法及甩尾法）。采用位置偏爱试验（Conditioning Place Preference）及纳洛酮催瘾戒断试验观察多次给予吗啡后的机体依赖特性，证明μ受体基因敲出小鼠失去位置偏爱性质及纳洛酮催瘾戒断症状。这种吗啡的机体依赖（Physical Dependence）作用及镇痛作用是通过μ阿片受体实现，缺失μ阿片受体基因的小鼠则由于没有μ受体而吗啡不产生镇痛作用及机体依赖的反应。这项工作是阿片受体研究的新进展。这种Knock Out技术的应用，对阐明受体功能无疑是十分重要的，是分子药理学研究很受关注的研究领域。
1998年Kieffer[13]实验室又报道了κ受体基因敲出小鼠制备成功。证明κ受体与内脏化学刺激疼痛有关。这是采用腹腔注射醋酸溶液引起腹部收缩扭体反应的扭体试验证明κ受体敲出小鼠对此刺激产生扭体阳性小鼠数比正常小鼠有显著的差别。而对炎症痛、压痛、热刺激疼痛等κ受体基因缺失鼠与正常鼠无差别。而κ受体选择性激动剂U-50488H对κ受体基因缺失小鼠的镇痛作用（甩尾法）消失。而U-50488H可产生的流涎，运动功能影响等也在此突变小鼠上消失。对吗啡在小鼠的作用，在κ受体基因缺失小鼠上镇痛作用，位置偏爱试验等无显著改变，但可影响吗啡多次应用，纳洛酮戒断症状有减弱影响。这是以竖毛、跳跃、腹泻、嗅探索等总体表现为指标，总评分（Global Withdrawal Score）为指标的比较结果。这一现象对了解阿片类成瘾机制有重要意义，补允了过去认为阿片类成瘾仅通过μ受体实验的观点，说明吗啡成瘾机制中有κ受体的参与。
M.Nishi等（1997，1998）[14、15]发表了nociceptin受体基因敲出小鼠的研究工作。他们观察到nociceptin系统在听觉调节中的作用，采用nociceptin受体基因敲出小鼠在一些行为表现中的变化，小鼠对痛觉（热板法、刺激脚趾法、甩尾法、扭体法）的阈值与正常鼠比较未有显著变化，对一般行为表现也无改变。但在Water finding试验中可见较正常小鼠空间探究的记忆（retention of spatial attention）增加。同时，在突变鼠的前脑皮质多巴胺系统实现的。
Pasternack等在INRC-1998年会上也报道了μ、δ、κ三种受体基因敲出小鼠镇痛作用的观察，发现δ受体基因敲除小鼠DPDPE及吗啡镇痛作用也有δ受体参与。他们宣称正在开展三类阿片受体缺失的各种组合突变小鼠的制备研究。这将对三类阿片受体在吗啡类镇痛及成瘾机理的进一步了解有十分重要的作用。
四、μ阿片受体内源性配体的新发现
这是1997年阿片受体研究的一个重要进展，在Nature杂志美国学者Zadina等[16]首先报道了这一成果。因为δ受体及κ受体的内源性配体早己发现，而迄今较高选择性的内源性μ受体的配体一直未找到，这一新的报道引起了广泛关注。而吗啡等药物广泛应用于临床镇痛，但久用可导致药物滥用而产生依赖成瘾，主要这些药物的作用是通过μ受体实现，因此，寻找内源性μ受体配体便显得十分重要。Zadina等报道，从牛前脑皮层中分离纯化得到两个高选择性μ受体的内源性配体，叫endomorphine-1（内源吗啡-1）及endomorphine-2（内源吗啡-2），均为四肽。endomorphine-1（Tyr-Pro-Phe-NH）具有μ受体的高亲和力，Ki=0.36nM，其选择性分别为δ受体及κ受体亲和力的4000倍及15000倍，亲和力比DAGO更强，在小鼠实验中可产生极强的镇痛作用，作用时程也长。其镇痛ED50为4.7nmol（icv），而吗啡为7.5nmol，作用剂量10μg时，可持续一小时以上，其作用可被纳洛酮对抗。endomorphine-2（Tyr-Pro-Trp-Phe-NH）对μ受体的亲和力Ki为0.69nM，为δ受体及κ受体亲和力的13000倍及750000倍。Icv给予小鼠，镇痛IC50为8.4μg。作者对 endomorphine-1用放射免疫法测定脑内分布，发现主要分布在丘脑、下丘脑、纹状体及前脑皮层等处。这一发现使大家对二内源性高选择性、高亲和力配体是否产生依赖很感兴趣，估计不久会有报道。也为新的强效镇痛剂研究提供新的开发途径，受体内源性配体的研究仍是分子药理学研究的热点之一。
五、高选择性、高亲和力配体研究仍是一个重要研究课题
因为这种高选择性配体是研究阿片受体亚型结构功能的必要工具，特别是某类选择性配体会有一些手性中心，具有多个立体异构体，比较这些异构体的生物活性及与受体结合的选择性差异，会对了解结构功能关系提供很重要的依据。我们实验室对羟甲芬太尼（OMF）研究己有很多报道[17、18]，由于OMF分子有三个手性中心，应有八个立体异构体，因此，最近我们对OMF的八个异构体进行定向合成，对它们与μ受体结合亲和力、选择性及镇痛活性比较，取得较有意义的结果。结果证明：其中F-9202（cis-3S，4R，2S-OMF）及F-9204（cis-3R，4S，2S-OMF）是两个目前国际上已有的μ受体激动剂中选择性最高者，其Ki（DPDPEδ）/Ki（DAGOμ）之比值分别为22800及22500。同时，其镇痛作用也是八个异构体中最强的，ED50分别为0.0011mg/kg及0.0047mg/kg。
受体与配体的相互作用机制必须在受体三级结构阐明的基础上才能根本解决。由于阐明膜受体三级结构必须有足够量的受体蛋白，并能制备好的晶体，进行X衍射分析三级结构困难极大，尚未见有膜受体蛋白三级结构成果的报道。目前，有不少科学家采用计算机模拟受体蛋白三级结构，研究受体与配体相互结合位点，虽然还存生不少缺点及不足之处，但这种办法还是可以提供一些信息，对新药设计、证明受体配体结合性质是有一定意义的。我们实验室与我所陈凯先教授实验室合作[19]，也开展了μ受体蛋白三级结构的计算机模拟，根据Rhodopsin三级结构（己阐明）为模板，对一级结构已阐明，以及OMF八个异构体的作用特性比较结果等数据，对μ受体蛋白三级结构建立模型，还分析了与F-9202、F-9204可能结合位点，认为Asp-147、Trp-318及His-319可能是结合位点。这一结果己在1996年发表。文章发表以后得到美国同行的注意，我室在NIDA Rothman实验室的访问学者徐衍、陆亦凤等与我们共同合作，利用点突变技术[20]，将受体蛋白中上述认为有关的几个结合位点，进行点突变，可以进一步证明这几个氨基酸残基与OMF结合的意义。徐、陆等合作研究的结果说明，如将受体蛋白分子中的Tyr-148、Trp-318及His-319分别被Phe或Ala置换，观察这些突变后受体蛋白配体的结合特性，发现点突变Trp-148后的受体大大下降了与配体的结合水平，置换His-319后，十分显著地下降受体的结合能力。这说明Tyr-148及His-319有芬太尼类配体的受体结合中起重要的作用。这工作己在Synapse（1998）发表。这在计算机模拟受体结构研究中，分析推算的受体配体结合位点，用分子生物学的实验验证，尚属少见。
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