2024年6月7日，西奈山伊坎医学院Paul J. Kenny教授研究团队在Science上发表论文“A master regulator of opioid reward in the ventral prefrontal cortex”。研究人员使用小鼠的全脑活动图谱发现，背侧脚核（dorsal peduncular nucleus，DPn）的神经元对阿片类药物羟考酮有高度反应，并确定了DPn投射到脑桥臂旁核（parabrachial nucleus，PBn）的兴奋性神经元群体介导厌恶样行为。

 

　　首先，研究人员对小鼠连续五天腹腔注射生理盐水或一定剂量的羟考酮以建立条件性位置偏好，小鼠在羟考酮匹配一侧的停留时间显著升高（图1A）。接下来作者对注射羟考酮2小时后的小鼠进行取脑，用IDISCO+透明化后进行c-Fos染色与三维重构。结果发现，与对照组相比，羟考酮处理组小鼠的DPn的c-fos表达显著升高（图1B-F）。接下来，作者研究了DPn在调节奖赏和厌恶相关行为中的作用（图1G）。在DPn脑区注射光激活病毒并植入光纤，三周后，进行实时位置偏好测试。结果表明小鼠在光激活一侧的停留时间显著降低，诱发了较为明显的厌恶样行为。但是如果在测试前15分钟腹腔注射羟考酮后，则会显著抑制小鼠的厌恶样行为（图1H-J）。接着为了研究对羟考酮响应的PBn神经元具有什么功能，作者使用TRAP2-Cre鼠腹腔注射羟考酮和4-羟基他莫昔芬（4-hydroxytamoxifen，4-OHT），光激活PBn对羟考酮响应的神经元，发现同样可以引起小鼠的厌恶样行为（图1K-M）。这说明激活DPn脑区可以引发厌恶样行为，而这种厌恶可以被羟考酮逆转。

 

　　作者尝试从结构上确定阿片类药物引发的DPn脑区神经元调节厌恶样行为的下游环路，因为毕竟这是一个没有被过多报道的核团。作者在TRAP2-Cre鼠的DPn脑区注射cre依赖的顺行示踪病毒，发现羟考酮激活的DPn脑区神经元可以广泛投射到许多脑区（图2A-C）。但作者觉得这种验证下游脑区的方法精确度不高，于是作者使用了示踪病毒结合测序的技术，这项技术的原理是利用病毒在每个神经元中插入一个独特的RNA条形码（barcode）序列来标记神经元。barcode中包含了一条mRNA转录本序列确保病毒能够在细胞内表达，同时还含有一个改造蛋白确保barcode能够和其他突触间传递的信息一起被传输。Barcode被转运到神经元的末端后，便可以通过测序进行检测分析，可以实现单神经元的精确追踪（图2D）。作者在DPn脑区注入混合病毒后取脑进行测序。结果发现与编码厌恶情绪相关的PBn的barcode密度较高，于是将PBn作为潜在下游靶标（图2E-K）。作者首先通过顺逆行示踪的策略确定两个脑区之间的结构连接（图2L-M），接着在TRAP2-Cre鼠的DPn脑区注射光遗传学激活病毒并在下游PBn埋置光纤。发现给光刺激后可以明显引起小鼠的厌恶样行为，具体表现为在给光一侧的停留时间显著升高（图2N-O）。

 

　　下一步，作者试图分析阿片类药物介导厌恶相关行为的DPn-PBn神经元的空间序列。于是使用基于荧光原位杂交的空间转录组学（Space-seq）来表征DPn（图3A-F）。根据基因表达的差异，作者对DPn中不同亚型的谷氨酸能（glutamate，Glu）神经元进行分析。作者根据基因表达差异将Glu划分为六个不同的亚型，其中3型和4型Glu都特异性表达Slc17a6，这是一个编码vglut2的转录本。对Allen小鼠大脑表达图谱的研究证实，DPn含有大量vGlut2+神经元。目前已经有较多的文献表明vGlut2+神经元参与了阿片类药物的奖赏和回避相关的行为反应。因此作者推断这些vGlut2+神经元可能介导了阿片类药物引起的厌恶样行为（图3G-I）。作者接下来在vGlut2-Cre小鼠的PBn脑区验证了DPnvglut2-PBn的结构连接。为了研究该条环路的功能，作者在vGlut2-Cre小鼠上游DPn注射光激活病毒，发现激活该条环路可以显著引起小鼠的厌恶样行为（图3J-S）。

 

　　为什么DPnvGlut2神经元对羟考酮反应如此强烈？作者使用单核RNA测序（SnRNA-seq）对注射生理盐水或羟考酮后的DPn进行单细胞测序。根据基因表达的不同可以分为14个不同的簇，但总体来讲实验组和对照组的基因表达差异不算太大（图4A-C）。Glu神经元被划分为了四个不同亚型（0，1，4，7），其中cluster 7的高表达vglut2，也检测到了高浓度的μ阿片受体Oprm1基因表达，从基因表达可以推断，vglut2基因表达可能和μ阿片受体表达之间存在正相关关系（图4D-H）。免疫荧光染色也证明了这一现象（图4I-L）。接下来，作者用小鼠脑片的全细胞记录来验证μ阿片受体对DPnvGlut2-PBn通路的功能影响，将rgAAV-DΙΟ-GFP注射到vGlut2-Cre小鼠的PBn中以标记DPnvGlut2-PBn神经元。作者发现，使用DAMGO（μ阿片受体激动剂）之后减少了由电流注入诱发的动作电位的数量，提示阿片类药物对DPnvGlut2-PBn神经元有抑制作用（图4M-W）。

 

　　最后，作者研究了DPn中μ阿片受体信号在调节羟考酮行为反应中的作用（图5A-E）。在条件位置偏好实验中，作者发现敲低DPn脑区的μ阿片受体表达后，小鼠在羟考酮匹配一侧停留时间显著缩短，这说明敲低DPn中的μ阿片受体会增强对羟考酮的厌恶反应（图5F-G）。食物奖励的操作性条件反射实验也说明注射羟考酮后，敲低小鼠的食物反应与对照组小鼠相比受到抑制，也可以说明阿片类药物会介导敲低μ阿片受体小鼠表现出厌恶样行为（图5H-I）。下一步作者研究分析了DPn脑区在阿片类药物戒断反应的作用。作者通过注射纳洛酮使小鼠产生戒断反应。与对照小鼠相比，μ阿片受体敲低小鼠的戒断表征更为明显，主要表现为理毛等痛苦样行为变高，这表明DPn中μ阿片受体信号的缺陷加剧了阿片类药物戒断反应（图5J-P）。药物依赖的病人，其戒断后的消极情感往往比躯体症状更严重。食欲降低往往可以表征啮齿动物阿片类药物戒断后出现的负面情绪程度。作者通过训练使小鼠可以自行获得食物颗粒，接着通过化学遗传抑制小鼠DPn的神经元活动。发现与非药物依赖组相比，药物依赖组小鼠给予纳洛酮处理后小鼠的食欲显著降低，但是抑制DPn脑区的神经元活动后小鼠对食物的反应显著升高（图5Q-U）。

 

　　综上所述，本研究确定了DPn中投射到PBn的兴奋性神经元群体。DPn-PBn神经元的激活有助于对阿片类药物的厌恶反应。DPn-PBn厌恶神经元的活性受到阿片类药物的直接抑制作用的限制。在阿片类药物依赖动物中，DPn神经元的活性也会导致阿片类物质戒断的厌恶症状（图6）。总之，这些发现表明，DPn神经元与阿片类药物的关键作用密切相关，这些作用有助于OUD的发展和维持。