【摘要】目的： 研究MOR-1，CCK-AR，CCK-BR在海马神经元的分布和吗啡对其受体的影响。 方法：用激光共聚焦扫描技术，以神经元特异性标记抗体NF-200对原代海马神经元进行鉴定，采用特异性的MOR-1，CCK-AR，CCK-BR的抗体观察观察它们在海马神经元上的表达。 选用雄性Wister大鼠，用剂量递增法皮下注射盐酸吗啡，对照组以同样的方法给予生理盐水后，取出大鼠海马组织用流式细胞技术检测不同时间吗啡作用于海马神经元时上述受体的表达。 结果： 海马神经元上同时表达MOR-1，CCK-AR及CCK-BR；给予吗啡后2~4 d，MOR-1在海马神经元上的表达较对照增高(P<0.05)，5 d时，MOR-1的表达显着下降(P<0.01)；随吗啡作用时间延长，CCK-AR和CCK-BR在海马神经元的表达呈上调趋势，且CCK-BR的表达高于CCK-AR (P<0.01)。 结论：海马神经元上同时存在MOR-1，CCK-AR和CCK-BR，吗啡作用时间越长，MOR-1表达越弱，而CCK-AR和CCK-BR表达越强。

　　【关键词】阿片受体；CCK-A受体；CCK-B受体；吗啡依赖；原代海马神经元；激光共聚焦；流式细胞术

　　研究表明μ受体（MOR-1）是吗啡等阿片类物质的主要作用位点，镇痛活性最强，成瘾性也最强［1-2］。另有实验研究表明：在中枢神经系统中广泛分布着一种典型的脑肠肽－胆囊收缩素(cholecystokinin octapeptide, CCK)，它是脑内含量最高的一种神经肽［3］，其通过CCK受体发挥生理作用。实验已证实：CCK受体拮抗剂不但能针对戒断症状进行对症治疗，而且有一定程度的防止复吸作用［4］，但具体机制尚未完全阐明。 本研究采用不同的实验技术，重点阐明MOR-1, CCK-AR及CCK-BR是否存在于海马神经元上以及吗啡在不同的时间点对3种受体的影响，为进一步研究CCK受体拮抗剂对吗啡依赖大鼠戒断症状的影响及其机制的研究奠定必要的基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　健康雄性Wistar大鼠，二级动物，由河北省实验动物中心提供（合格证号：冀医动字第602054）。 盐酸吗啡(morphine hydrochloride，MOR)，沈阳第一制药厂生产，批号：辽宁药准字(1996)第002747号。 DMEM培养基、Neurobasal Medium，B27  (美国Gibco公司)；山羊抗CCK-A，山羊抗CCK-B抗体，兔抗MOR-1多克隆抗体，FITC donkey anti mouse IgG，Biotin donkey anti rabbit IgG(美国Santa Cruz公司)；TRITC rabbit anti goat IgG，FITC rabbit anti goat IgG， FITC goat anti rabbit IgG(北京中山生物公司)；CY5 anti rabbit IgG(Camical公司)；小鼠抗NF-200单克隆抗体(NEO MARKERS公司)；兔抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）多克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)；激光共聚焦显微镜(德国Leica)；Epics XL流式细胞仪(美国Beckman Coulter)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 原代大鼠海马神经元培养

　　取出生1 d的大鼠在无菌条件下分离海马组织，制备细胞悬液，用含B 27 Supplement的NBM进行原代海马神经元培养。

　　1.2.2 神经元鉴定

　　取培养6 d的大鼠海马神经元，用免疫荧光标记技术进行鉴定，一抗分别为GFAP多克隆抗体和NF-200单隆抗体，二抗分别为Biotin donkey anti rabbit IgG＋CY5 anti donkey IgG和FITC donkey anti mouse IgG，标记后选择不同视野细胞进行激光共聚焦扫描40ｘ（激发波长488 nm，发射波长530 nm）。

　　1.2.3 MOR-1，CCK-AR，CCK-BR在海马神经元的表达

　　将原代海马神经元随机分为NF200/MOR-1，NF200/CCK-AR，NF200/CCK-BR 3组，特异性抗体同上，用免疫荧光标记和激光共聚焦扫描技术检测受体的表达。

　　1.2.4 MOR-1，CCK-AR，CCK-BR在吗啡处理大鼠海马神经元的表达

　　1.2.4.1 给药与分组

　　60只健康雄性Wistar随机分为对照组（control），M1～M9组（分别给予MOR 1~9 d），大鼠参照文献［5］以剂量递增法背部皮下给予吗啡，首日吗啡20 mg/kg，分2次皮下注射(8：00, 18：00)。 以后每日增加20 mg/kg，9 d 8：00末次注射吗啡1 h后取大鼠海马。 每组n=6。

　　1.2.4.2 大鼠海马神经元的分离及检测

　　9 d 08：00末次注射吗啡1 h，按照本实验室方法分离海马［6］，制备细胞悬液，台盼蓝染色鉴定细胞活性大于95％。 无血清DMEM调整细胞浓度至2×106/mL， 用流式细胞仪随机测定单个细胞的荧光强度值（激发波长488 nm， 发射波长530 nm）。 每份标本10 000个细胞的平均荧光强度值为测定值， 用以反映受体蛋白表达。

　　统计学处理：实验数据用x±s表示。 用SPSS 13.0统计分析软件进行统计学分析。 各组均数的比较采用Dunnett t检验进行两两比较，将CCK-AR与CCK-BR作为整组采用配对T检验对两组间进行比较， P<0.05为有统计学差异。

　　2 结果

　　2.1 体外培养

　　海马神经元的鉴定结果显示：NF阳性细胞标记绿色荧光，GFAP标记蓝色荧光，在整张盖片，NF阳性细胞90％以上，同时有散在的GFAP阳性细胞(图1)。

　　2.2 MOR-1, CCK-AR及CCK-BR在海马神经元的表达

　　在海马神经元膜，轴突和树突上均有发蓝色荧光的MOR-1阳性表达产物（图2A，D）；绿色荧光标记物与红色荧光标记物重叠之后呈橙黄色荧光，CCK-A, CCK-B受体呈橙黄色标记,在海马神经元膜表面广泛分布（图2B，C，E，F）。

　　2.3 吗啡对大鼠海马神经元MOR-1, CCK-AR, CCK-BR表达的影响

　　采用流式细胞技术检测给予吗啡后MOR-1，CCK-AR，CCK-BR在海马神经元上的表达。 给予吗啡2 d时MOR-1上调(P<0.05)，5 d时 MOR-1开始出现下调，蛋白表达量显着下降(P<0.01)，并呈时间依赖性。 给药2 d，CCK-B受体的荧光强度值较对照组相比显着升高(P<0.05)。 给药5 d，CCK-A受体的荧光强度值较对照组显着升高(P<0.01，表1)。 同一时间点CCK-B受体的荧光值高于CCK-A受体(P<0.01，表1)。表1吗啡对大鼠海马神经元MOR-1, CCK-B和CCK-A受体表达的影响(略)

　　3 讨论

　　阿片类物质长期作用会引起细胞的一些适应性改变，如阿片受体下调、内吞以及环磷酸腺苷(cAMP)信号转导系统的上调等，可能与阿片耐受和依赖的形成有关［7］。 μ受体介导了吗啡的身体依赖性和精神依赖性［8］。 在吗啡依赖状态下，海马、纹状体、丘脑、下丘脑的μ受体特异性结合密度发生非常显着下降［9-10］。 本实验选择海马为靶区，模拟自然吗啡依赖形成过程，来观察μ受体的变化。 结果显示μ受体（MOR-1）存在于海马神经元的细胞膜、轴突及树突膜上。 这与已有的研究结果类似［11］，其机制可能是由于受体磷酸化和去磷酸化反应之间的失衡所致μ受体基因表达下降或膜上μ受体发生内吞。

　　CCK是脑内含量最高的一种神经肽［12］，其作用与阿片受体拮抗剂不同，它不是直接阻断阿片受体，而是激活CCK受体，使阿片受体的结构和功能发生变化，与阿片的结合力降低。 该研究说明CCK受体与阿片受体直接对话。 连续注射吗啡6 d，使大鼠多数脑区CCK 8含量升高，CCK mRNA含量显着增高［13］。 Blandine等［14］证实，CCK-B受体的缺失可以导致内源性阿片肽的增量调节。 CCK 8可能参与吗啡依赖的形成。 但不同时间点吗啡对大鼠海马神经元CCK受体的影响报道甚少，为此我们通过LSCM观察了CCK-A和CCK-B受体在海马神经元上的表达，并应用流式细胞技术检测吗啡作用下CCK-A和CCK-B受体在不同时间点的蛋白表达。 证实CCK-A，CCK-B受体广泛存在于神经元的细胞膜、轴突及树突膜上，而且表达量很高。 且海马神经元以CCK-B受体为主。 CCK 8作为很强的内源性抗阿片肽，在阿片介导的疼痛、耐受及成瘾中起到了非常重要的作用。 CCK受体可与阿片受体直接作用或通过受体后机制相互影响。 但μ阿片受体与CCK受体之间存在何种相关性有待于进一步研究。

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