内阿片肽作为一类重要的神经递质对神经、感觉运动、免疫等系统的功能具有重要调节作用，尤其对病的调节作用最为突出。而阿片类药物以强大的镇痛作用、情绪效应和成瘾性成为一类极其重要的药物。经典药理学实验和最近的基因敲除实验都证实：内阿对肽的功能、阿片类药物的镇痛作用及其长期使用所导致的药物耐受、成瘾都是由体内的阿冲受体所介导。

    阿片受体属G蛋白偶联受体(GPCR)，分为μ、δ、κ三种亚型。阿片受体与激动剂结合后激活Gi蛋白，使G蛋白的βγ亚基与α亚基解离。βγ亚基与α亚基分别介导了胞内多条信号通路的激活，如腺苷酸环化酶活性的抑制、G蛋白偶联受体激酶(GRK)、PKC和MAPK的激活等。在激动剂的长期作用下阿片受体介导的信号会逐渐减弱，即产生脱敏。阿片受体的脱敏被认为是机体对阿片类药物产生耐受性和成瘾性的分子机制之一。

    目前，G蛋白偶联受体的脱敏研究工作主要是以β2-肾上腺素受体和视紫红质受体作为模型的。研究认为：G蛋白偶联受体的磷酸化（包括同源磷酸化和异源磷酸化）、调节蛋白β-arrestin与磷酸化的受体的结合而导致的受体的内吞以及受体的下调等是GPCR脱敏的主要机制。在GPCR的同源脱敏中，GRK催化的受体磷酸化被认为是受体脱敏的一个关键环节。

    阿片受体同源磷酸化和异源磷酸化都已被许多实验室所报道。其中，催化阿片受体发生异源磷酸化的蛋白激酶有PKC和酪氨酸激酶等。但在激动剂诱导的阿片受体同源磷酸化研究中，大量实验数据提示GRK起关键作用。然而，激动剂诱导的阿片受体磷酸化的确切位点、GRK催化受体发生磷酸化的位点，目前仍未见报道。我们实验室最近的研究证实：δ阿片受体（DOR）的内吞、DOR与β-arresti的相互作用需要DOR的C末端区，并且，激动剂依赖的DOR的磷酸化位点位于其Ｃ末端区。

    小鼠δ阿片受体的C末端区含有四个苏氨酸残基和两个丝氨酸残基，它们是潜在的磷酸化位点。为了研究激动剂诱导下DOR的磷酸化具体发生于哪一个位点，我们首先构建了C末端区缺失六个丝/苏氨酸残基及三个丝/苏氨酸残基的DOR突变体△31和△15。在转染HEK293细胞48小时后，放射配体结合实验、免疫沉淀实验以及免疫荧光实验的结果都显示，受体C末端区的缺失不影响配体与受体的结合及受体的表达。[35S]GTPγS结合分析方法及cAMP放射免疫分析方法对受体介导的功能的检测结果发现，DOR的C末端区的缺失不影响激动剂诱导的G蛋白的活化和细胞内cAMP水平的下调。以上结果表明：C 末端区的缺失不影响受体的表达及其与G蛋白的偶联。

    在用 △31、△15或野生型受体转染HEK293细胞48小时后，我们采用32Pi标记细胞，在DOR特异激动剂DPDPE刺激后，通过免疫沉淀富集受体，SDS-PAGE分离受体，最后通过磷屏扫描仪或者Ｘ光片放射自显影，观察受体的磷酸化水平。结果发现：野生型受体发生磷酸化， △31不发生磷酸化，而△15虽然缺失T358、T361和S363但仍含有S344、T352、T353三个潜在磷酸化位点，却不发生磷酸化。这表明DOR的C末端的含有T358、T361、S363等三个潜在磷酸化位点的最后15个氨基酸践基是激动剂诱导的DOR发生磷酸化所必需的。进一步研究发现，T358、T361、S363都被甘氨酸或两氨酸取代的δ阿片受体M3也不发生磷酸化，T358、T361、S363等分别被甘氨酸或丙氨酸取代的受体，DPDPE刺激的磷酸化与野生型受体相比下降了80-100%，而在同样条件下，S344、T352、T353被甘氨酸或丙酸取代对受体磷酸化没有影响。证明：激动剂诱导的DOR的磷酸化发生于DOR的C末端区的最后三个丝/苏氨酸残基之中，T358、T361和S363这三个氨基酸残基对激动剂诱导的DOR的磷酸化都有重要贡献。

    许多数据提示：激动剂诱导的阿片受体磷酸化是由GRK介导的，而PKA、PKC都不参与。我们的研究发现，GRK2的过量表达，使野生型受体的磷酸化增加了150%，但却不能使突变体△13、 △15及M3发生磷酸化。这一结果表明：GRK2催化DOR发生磷酸化的位点位于T358、T361和S363这最后三个丝/苏氨基酸残基中，提示GRK是激动剂诱导的DOR磷酸化过程中最主要的蛋白激酶。T358、T361、S363在 GRK介导的DOR磷酸化过程中，可通过两种方式发挥作用，一种方式是其本身即为磷酸基因的接受者(phosphate acceptor)，另一种方式是其本身虽不是磷酸基团的接受者，但却可参与受体与GRK间的相互作用。为了尽量减弱以甘氨酸或者丙氨酸取代可能对受体与GRK相互作用造成的影响，我们用天冬氨酸(D)分别取可能对受体与GRK相互作用造成的影响，我们用天冬氨酸(D)分别取代T358、T361和S363这三个丝/苏氨酸残基。结果发现，将361位苏氨酸残基取代为天冬氨酸残基不影响激动剂诱导的受体磷酸化，共表达GRK2对T361D磷酸化的增强也与野生型受体没有显著差异。在HEK293细胞中单独表达T358D或S363D，在激动剂刺激后，没有检测到受体的磷酸化。但在共转染GRK2增加细胞内GRK浓度的情况下，T358D和S363D都能够被磷酸化；T358和S363同时突变为天冬氨酸的受体(D2)，在共表达或不共表达GRK2的情况下，都不能发生磷酸化。这些结果表明：T358、T361和跟S363这最后三个丝/苏氨基酸残基在GRK2催化DOR发生磷酸化过程中都有重要作用。其中T361是受体与GRK2相互作用的关键位点，而T358和S363都是GRK2 的磷酸化位点，而且激动剂作用下在受体上只有这两个丝/苏氨基残基能够被GRK2催化发生磷酸化。但生理浓度GRK2情况下，激动剂诱导的DOR的磷酸化只发生在T358或S363两点中的一点，其中任一点发生磷酸化后，会阻碍受体与GRK2的相互作用，从而抑制GRK2催化另外一点发生磷酸化。

    GRK5是结合于细胞膜上的G蛋白偶联受体激酶的代表，有研究证明它也参与了激动剂诱导的DOR的磷酸化。我们的研究结果显示：GRK5催化受体发生磷酸化的位点也位于C末端区T358、T361、S363这最后三个丝/苏氨酸残基中。但T358、T361、S363在GRK5和GRK2催化受体磷酸化过程中的作用并不相同。其中T358是GRK5的磷酸化位点，同时又是GRK2的磷酸化位点；T361是GRK5的磷酸化位点，它又是GRK2与受体相互作用的关键氨基酸残基；而S363是GRK2的两个磷酸化位点之一，它在GRK5催化受体磷酸化中不起关键作用。进一步研究发现，GRK2和GRK5可在不同的位点上催化受体同时发生磷酸化，而且T358被催化发生磷酸化后可增强受体与GRK5之间的相互作用而增强GRK5介导的受体磷酸化水平，但DOR的C末端区的T358、T361和S363却不能三点同时被GRK2和GRK5催化发生磷酸化。

    为了研究GRK介导的DOR磷酸化对受体介导的信号转导的调控作用，我们将GRK5和GRK2分别与DOR共表达在HEK293细胞中，GRK5和GRK2的表达显著地减弱了DOR介导的对细胞内腺苷酸环化酶活性的抑制作用，GRK2磷酸化位点T358和S363３的突变明显抑制了GRK2对受体反应性的这种调控作用，GRK2与受体相互作用位点T361的改变也部分地抑制了GRK2的调控作用。S363的突变对GRK5的调控作用影响较小，GRK5两个磷酸化位点T358或T361的突变部分地抑制了GRK5对受体反应性的调控作用。这些结果表明：GRK对受体介导的信号转导的调控是由GRK催化的受体磷酸化介导的；虽然GRK5与GRK2都能催化DOR发生磷酸化并调控受体介导的信号转导，但它们发挥作用所必需的DOR的C末端区的结构不尽相同。

    关键词：阿片受体、受体磷酸化、脱敏、G蛋白偶联受体激酶、突变