【摘要】目的：研究吗啡耐受和依赖时某些第二信使分子和阿片受体变化及与谷氨酸受体的关系。方法：竞争性蛋白结合法、共聚焦显微镜技术和受体结合实验检测cAMP水平、胞内钙和阿片受体变化。结果：在表达诱导型一氧化氮合酶cDNA神经细胞中，吗啡急性刺激剂量依赖性抑制cAMP生成，慢性用药引起cAMP代偿性增加。谷氨酸受体拮抗剂MK801增强吗啡的急性抑制效应，抑制阿片受体介导cAMP系统脱敏。对吗啡慢性给药细胞，用吗啡刺激和纳络酮戒断引起［Ca2＋］i增加，阿片受体Kd值增加和Bmax值减少，MK801对这些指标的改变没有影响。结论：MK801减轻阿片耐受和依赖的机制可能不是改变阿片受体特性，主要与受体后信号转导有关。

    关键词：吗啡；麻醉品依赖；受体，谷氨酸；第二信使系统；受体，阿片样

　　吗啡长期使用易致镇痛耐受、心理/身体依赖、戒断综合征和自身给药行为。研究者努力寻找较少出现依赖倾向的非阿片类药物缓解吗啡耐受和成瘾，新近发现谷氨酸受体参与阿片耐受和依赖，动物实验表明，N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA）受体非竞争性拮抗剂MK801本身无明显的镇痛作用，但抑制吗啡耐受发生，使吗啡镇痛效应曲线左移，还能减轻纳络酮诱发的吗啡戒断症状〔1，2〕，但其阻断吗啡耐受和戒断的神经生化机制尚不清楚。本文从细胞水平研究了MK801对吗啡耐受和依赖时cAMP生成、胞内钙和阿片受体变化的影响。

　　材料与方法

　　一、药品和试剂　MK801（5-methyl-10，11-dihydro-5H-dibenzo［a，d］cycloheptan-5，10-iminemaleate)为Fluka公司产品。盐酸吗啡和盐酸埃托啡(etorphine，Etor)为青海制药厂产品。纳络酮、腺苷酸环化酶(adenylate　cyclase，AC）激动剂Forskolin、磷酸二酯酶抑制剂isobutylmethylxanthine（IBMX）和荧光染料指示剂Fluo-3／AM购自Sigma公司；3H-Etor为上海原子能研究所产品。

　　二、cAMP含量测定　竞争性结合蛋白法测定［3］。

　　三、胞内游离钙测定［4］　在药物预处理细胞中，加入2μmol·L－1Fluo-3／AM，37℃温育45分钟。将细胞置于激光共聚焦扫描显微镜，依次加入吗啡和纳络酮，观察Ca2＋荧光强度的变化。

　　四、受体配基结合实验　采用完整细胞阿片受体结合实验［5］，用Origin软件对放射配基3H-Etor受体结合饱和曲线做最佳非线性拟合及Scatchard分析。

　　五、细胞株和细胞培养　神经母细胞瘤和神经胶质瘤NG108-15杂交细胞株常规生长于含有10%新生牛血清的高糖DMEM培养基中。由本组将iNOS　cDNA重组逆转录病毒载体转染NG108-15细胞，建立了NG-LNCXiNOS细胞株［6］；转染带有Neo基因的空载体获得NG-Neo细胞株，这二种细胞株在含有200mmol·L－1G418完全培养基中传代培养。

　　六、吗啡急性镇痛和耐受/依赖体外细胞模型的建立［7］　吗啡急性刺激体外培养细胞引起cAMP含量降低，作为吗啡镇痛的检测指标；吗啡慢性作用细胞和用纳络酮急性戒断，诱发cAMP代偿性增加和反弹性升高现象，建立吗啡耐受/依赖的细胞模型。

　　七、统计学分析　实验数据用±s表示，采用方差分析和t检验。P＜0.05认为有显著性差异。

　　结果

　　一、吗啡急性和慢性作用诱发cAMP含量变化及谷氨酸受体的调节作用

　　1.吗啡引起cAMP含量变化的时效关系和量效关系　NG108-15细胞、NG-Neo细胞和NG-LNCXiNOS细胞用10μmol·L－1吗啡进行不同时间预处理，以Forskolin对照的cAMP含量为100%，吗啡急性刺激使胞内cAMP含量比Forskolin对照降低了34.4%、44.3%和38.9%。随着吗啡给药时间延长，cAMP含量逐渐上升，药物作用至24小时已趋于Forskolin对照水平，48小时甚至超过Forskolin对照水平(表1)，三种细胞株cAMP生成变化规律基本一致。

细胞株	时间(h)
	0.25	1	6	12	24	48
NG108-15细胞 　　NG-Neo细胞 　　NG-LNCXiNOS细胞	34.4 　　44.3 　　38.9	63.2 　　65.7 　　77.4	56.2 　　78.1 　　84.9	80.9 　　85.6 　　90.9	100.3 　　102.5 　　93.5	110.7 　　105.4 　　107.8

表1　吗啡(10μmol·L－1)作用不同时间点对胞内cAMP生成量(%)的影响(5株)

　　10μmol·L－1吗啡预处理NG-LNCXiNOS细胞48小时，观察吗啡(1nmol·L－1～10μmol·L－1)急性刺激对胞内cAMP形成的影响。结果表明，对照细胞和吗啡耐受细胞均使胞内cAMP生成减少，剂量效应呈负相关，最大抑制率由61.2%减少到33.7%，IC50从170nmol·L－1增加到380nmol·L-1。最高剂量吗啡急性刺激，吗啡耐受细胞cAMP含量明显高于对照细胞(P＜0.05，表2)。

吗啡浓度 　　(mmol·L－1)	cAMP含量(Pmol·mg－1)
	对照细胞	吗啡耐受细胞
Forskolin对照 　　100 　　101 　　102 　　103 　　104	492±25 　　516±26 　　425±21 　　389±19 　　330±16 　　191±10*	527±32 　　486±29 　　484±29 　　476±28 　　383±23 　　349±21△

表2　吗啡慢性处理细胞后对吗啡急性刺激抑制cAMP生成的影响(5株，±s)

　　与Forskolin对照比较，*P＜0.05　与对照细胞比较，△＜0.05 　　2.MK801对吗啡急性刺激抑制cAMP生成影响1μmol.L－1MK801单独作用细胞48小时，与Forskolin对照组相比无明显差异(P＞0.05，表3)。1nmol·L－1～10μmol·L－1吗啡单独作用细胞15分钟，cAMP含量剂量依赖性降低，加入10μmol·L－1纳络酮可拮抗吗啡的抑制效应。1μmol·L－1MK801预处理细胞48小时后，再用吗啡急性刺激，随着吗啡用药剂量增加，cAMP含量降低，吗啡浓度达到10μmol·L－1时，MK801预处理细胞cAMP含量低于对照细胞(P＜0.05，表3)。

吗啡浓度 　　(nmol·L－1)	对照细胞		MK801预处理细胞
	纳络酮(-)	纳络酮(+)	纳络酮(-)	纳络酮(+)
对照组 　　100 　　101 　　102 　　103 　　104	500±51 　　459±21 　　380±29 　　289±44 　　271±17* 　　210±11*	504±33 　　511±46 　　484±31 　　383±45 　　380±29 　　398±19	461±39 　　430±50 　　298±21 　　310±17 　　211±25* 　　156±8**△	544±25 　　523±42 　　394±26 　　373±10 　　290±26 　　309±33

表3　MK801对吗啡急性抑制cAMP生成(pmol·mg－1)效应的影响(5株，±s)

　　与对照比较，*P＜0.05　**P＜0.01　与对照细胞吗啡用药组比较，△P＜0.05

　　3.MK801对吗啡慢性作用引起cAMP代偿性增加的影响　用吗啡(10μmol·L－1）预处理细胞48小时，再用1μmol·L－1吗啡急性刺激，胞内cAMP含量(487±28)与对照组(509±18)无差异(n=5，P＞0.05)。加入纳络酮后，cAMP(518±47)有所增高，MK801+吗啡组cAMP(356±22)低于吗啡组(487±28)(n=5,P＜0.05)。

　　二、吗啡耐受和依赖时［Ca2＋］i变化及谷氨酸受体的调节作用

　　10μmol·L－1吗啡慢性预处理细胞，再用1μmol·L－1吗啡急性刺激，如图1可见Ca2＋荧光强度略有增高，再加入10μmol·L－1纳洛酮可使荧光强度继续升高。MK801和吗啡联合作用的细胞与吗啡单独用药的细胞结果非常类似，结果见图1。

　　 　A.　[[image1]][[image2]]B.
图1　用Fluo-3/AM负载吗啡慢性预处理细胞(A)及MK801与吗啡联用预处理细胞(B)，再用吗啡急性刺激和纳络酮戒断，引起［Ca2＋i］变化的荧光图像

　　三、谷氨酸受体拮抗剂对吗啡耐受细胞阿片受体变化的影响

　　3H-Etor受体饱和曲线和Scatchard分析表明，对照细胞Kd为1.48nmol·L－1，Bmax为382fmol·mg－1；吗啡耐受细胞Kd为2.80nmol·L－1，Bmax为180fmol·mg－1；MK801和吗啡联合给药的细胞Kd为2.27nmol·L－1，Bmax为167fmol·mg－1；提示本实验所建立吗啡耐受的NG-LNCXiNOS细胞模型阿片受体亲和力和密度下降，MK801不能阻断吗啡耐受细胞的阿片受体下调。

　　讨论

　　在NG108-15细胞膜上，含丰富的δ-阿片受体［8］，并且有功能性NMDA受体［9］，但表达NOS活性的基础水平较低。为研究阿片受体和NMDA受体信号转导系统的交叉作用，以及阻断NMDA-NO-cGMP通路药物抗阿片耐受和依赖的机制，我们采用基因转移技术，将重组iNOS基因导入该细胞，建立稳定表达iNOS的NG-LNCXiNOS神经细胞株［6］。本研究表明，吗啡慢性给予NG-LNCXiNOS细胞株，对Forskolin刺激cAMP生成的抑制作用呈时间依赖性减弱，与NG108-15细胞，NG-Neo细胞的结果完全一致，提示LNCXiNOS细胞株对研究阿片受体介导cAMP系统的调节作用也是较理想的模型。

　　阿片受体生化和药理学研究表明，吗啡慢性给予体外培养神经细胞，使G蛋白耦联的受体和效应蛋白发生适应性改变，包括受体脱敏(desensitization)和受体下调(downregulation)。Puttfarcken等［10］报告吗啡慢性作用含有μ阿片受体7315C垂体肿瘤细胞，引起μ受体脱敏和受体下调。在神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞株，吗啡急性作用抑制AC活性，慢性作用导致抑制效应减弱，AC功能代偿性增加，受体脱敏，阿片受体拮抗剂诱发戒断时，导致AC活性反跳性增加。本研究用吗啡处理NG-LNCXINOS细胞，引起cAMP生成的双相变化。MK801能增强阿片对cAMP生成的急性抑制作用，部分阻断吗啡慢性作用所致的cAMP变化，这可能是MK801阻断阿片耐受和成瘾的机制之一，尚需进一步动物实验证实。

　　本实验还发现MK801不能阻断吗啡诱发耐受和戒断时［Ca2＋］i升高，可能由于谷氨酸受体兴奋诱导胞内［Ca2＋］i的原因主要为NMDA受体耦联的阳离子通道开放［11］，而阿片耐受和依赖时［Ca2＋］i升高的另一主要来源是胞内Ca2＋动员增加［12］，可能是MK801对肌浆网释放Ca2＋释放没有影响。

　　研究表明，MK801不能阻断吗啡耐受所致的阿片受体下调，提示谷氨酸受体拮剂的抗阿片耐受和戒断作用可能不是通过改变阿片受体结合特性。3H-纳络酮受体结合实验显示，NMDA受体与阿片受体配基的交叉亲和力极低。大剂量竞争性NMDA受体拮挤剂LY274614不干扰μ-、δ-、κl或κ3高选择性配基与相应阿片受体结合［13］。在吗啡耐受大鼠，LY274614长期用药后，μ-、δ-、κ受体配基与脑突触膜上阿片受体的亲和力也无明显变化［14］，支持本实验用体外培养细胞获得的结果。

　　本课题为国家自然科学基金资助项目No.39670827

　　参考文献：

　　1 Dunbar SA，Pulai IJ.Repetitive opioid abstinence causes progressive hyperalgesia sensitve to N-methyl-D-aspartate receptor blockade in the rat．J Pharmacol Exp Ther，1998，284：678-686.

　　2 Dunbar S，Yaksh TL．Concurrent spinal infusion of MK801 blocks spinal tolerance and dependence induced by chronic intrathecal morphine in the rat．Anesthesiology，1996，84：1177-1188.

　　3 徐叔云，卞如濂，陈修，主编.药理实验方法学.第1版.北京：人民卫生出版社，1981.318-323.

　　4 Donnadieu E，Bourguignon LYW．Ca2＋ signaling in endothelial cells stimulated by bradykinin：Ca2＋measurement in the mitochondria and the cytosol by confocal microscoopy．Cell Calcium，1996，20：53-61.

　　5 Law PY，Bergsbaken C．Properties of Delta opioid receptor in neuroblastoma NS2OY：receptor activation and neuroblastoma proliferation．J Pharmcol Exp Ther，1995，272：322-332.

　　6 臧梦维，沈琦，汪青，等.逆转录病毒载体介导诱导型NO合酶在神经细胞中表达.生物化学和生物物理学报，1999，31：18-23.

　　7 Ammer H，Schulz R．Chronic activation of inhibitory δ-opioid receptors cross-regulates the stimulatory adenylate cyclase-coupled prostaglandin E1 receptor system in neuroblastoma x glioma（NG108-15)hybrid cells．J Neurochem，1995，64：2449-2457.