摘要: 目的:筛查海洛因依赖者在第9、10和11号染色体上的易感基因的位点。方法：对10例海洛因依赖者和其正常同胞对照者的第9、10和11号染色体进行以短串联重复序列（short tandem repeats，STR）为遗传标记的基因扫描分析。结果：D9S286，D9S167，D9S164和D10S208，D10S196，D10S185，D10S1693位点的等位基因在海洛因依赖组和其正常同胞对照组之间分布有显著性差异（χ2检验，P<0.05）, 其它STR位点的等位基因在海洛因依赖组和其正常同胞对照组之间分布没有显著性差异（χ2检验，P>0.05）。结论: 9号染色体上D9S286，D9S167，D9S164位点和10号染色体上D10S208，D10S196，D10S185，D10S1693位点附近可能存在海洛因依赖的易感基因。

    关键词: 海洛因; 染色体; 短串联重复序列

    近年研究表明药物依赖与多基因作用有关，是一种受社会环境因素和个体遗传因素综合作用的行为疾病[1]。动物实验证实药物依赖的形成受遗传因素的影响，如Lewis大鼠较Fischer大鼠更容易造成对酒精和可卡因口服液自身给药的行为模型，对吗啡容易成瘾的和抗吗啡成瘾的大鼠也被选育繁殖出来[2]。已有研究表明μ和δ阿片受体基因的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP），前脑啡肽基因，D2，D３，D4和D５多巴胺 受体基因多态性与海洛因依赖易感有关[3]。微卫星（microsatellite）亦称短串联重复序列（STR），是以2-6个碱基为核心单位的串联重复序列，广泛分布于人类基因组，多存在于非翻译区和内含子中，由于核心序列重复次数不同造成每个位点的高度多态性并呈孟德尔共显性遗传。利用微卫星两端的保守序列设计特异性引物，用PCR技术扩增STR, 经电泳分离后可显示不同个体在此位点的多态性。STR在人类遗传图构建和基因定位中已被广泛应用，以微卫星为遗传标记进行大规模的基因组扫描技术已成为当今疾病基因定位的重要工具。目前在9、10和11号染色体上已定位千余个基因，有多个基因与神经系统的功能有关。本文应用基因组扫描技术来分析9、10和11号染色体上的海洛因依赖易感基因的位点。

    1 材料与方法

    1.1 样本来源 宁波戒毒研究中心收治的10例海洛因依赖者，均符合DSM-Ⅳ阿片依赖的诊断标准，吸食海洛因时间均在１年以上，年龄22-37岁，其中男性8例，为海洛因依赖组。他们正常的同胞共10例，年龄24-41岁，无阿片类药物滥用史，尿吗啡检测阴性，作为同胞对照组。

    1.2 DNA提取 按常规酚:氯仿法提取外周血细胞基因组DNA，紫外分光光度法定量，稀释至50ng/μl备用。

    1.3 STR位点选择 选取第9号染色体上20个STR位点，第10号染色体上20个STR位点，第11号染色体上17个STR位点，覆盖整条染色体，相邻两位点平均间距为10cM，最大间距13.9cM，最小间距2.4cM。这57个STR位点是：D9S288，D9S286，D9S285，D9S157，D9S171，D9S161，D9S1817，D9S273，D9S175，D9S167，D9S283，D9S287，D9S1690，D9S1677，D9S1776，D9S1682，D9S290，D9S164，D9S1826，D9S158，D10S249，D10S591，D10S189，D10S547，D10S1653，D10S548，D10S197，D10S208，D10S196，D10S1652，D10S537，D10S1686，D10S185，D10S192，D10597，D10S1693，D10S587，D10S217，D10S1651，D10S212，D11S4046，D11S1328，D11S902，D11S904，D11S935，D11S905，D11S987，D11S1314，D11S937，D11S901，D11S4175，D11S898，D11S908，D11S925，D11S4151，D11S1320，D11S968。所选取的STR重复单位均为二核苷酸(AC)n，荧光标记的STR位点的引物由ABI公司LMSV2试剂盒提供。

    1.4 PCR反应 根据引物的荧光标记和扩增片段的长度将引物分组进行多重PCR反应。反应体积为10μl，含基因组DNA 50ng，每种引物0.05μM， dNTPs 200μM，Taq DNA 聚合酶0.4U，2.5mM MgCl2，1×PCR缓冲液。所用试剂由ABI公司Allele PCR试剂盒提供。用德国Eppendorf 公司PCR仪，采用两相循环：95℃12min后进入第一相循环，94℃变性30sec，48℃退火1min，72℃延伸1min，每次循环后退火温度递增0.5℃，15个循环后进入第二相循环，89℃变性30sec，55℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环后72℃延伸10min，置4℃备用。

    1.5 PCR产物电泳 取1μl PCR产物与12μl甲酰胺和0.1μl ABI GS500分子量标准混合，95℃变性3min，置冰浴中，以保持DNA单链状态。上样于ABI310测序仪，ABI POP-4凝胶毛细管电泳30min，电压15kV，温度60℃。

    1.6数据处理 用GeneScan软件收集数据，根据分子量内标自动分析各片段大小。用Genotyper软件进行各位点的基因分型。χ2检验进行统计学分析。

    2 结果

    2.1 通过软件得到的每位点所有样本的等位基因片段，是一系列相差2bp整数倍的片段。简单的以等位片段的长度命名基因型。

    表1 部分STR位点的等位基因在海洛因依赖组和同胞对照组中的频率分布(n=20) [略]
    *:P<0.05; n:Number of chromosomes

    2.2 统计学分析：经χ2检验，D9S286，D9S167，D9S164 和D10S208，D10S196，D10S185，D10S1693位点的等位基因在海洛因依赖组和同胞对照组之间分布差异有显著性意义（P<0.05），见表1。其它位点的等位基因在海洛因依赖组和其正常同胞对照组之间分布没有显著性差异（χ2检验，P>0.05）（数据未列出）。

    3 讨论

    实验动物的研究表明药物依赖存在种间差异，表现为：对药物的敏感性不同，觅药行为的差异以及戒断反应症状的差异。许多实验证实不同遗传背景的SD、Lewis和Fisher大鼠在药物依赖易感性的差异是与中脑多巴胺系统和阿片系统的功能有关的。药物依赖还存在个体差异，相同实验条件下SD大鼠自身给药行为存在高反应组和低反应组的动物，而药物在两组动物的大脑中浓度没有明显差异。国外对家系和双生子的调查发现：阿片依赖者的亲属中有药物滥用的比例明显高于非阿片依赖者的亲属，同卵双生子中药物滥用和依赖的一致性比例明显高于异卵双生子。可以推测在药物依赖中存在着若干基因的遗传影响, 以现在的研究来看，海洛因依赖易感性基因主要与阿片受体和受体后系统，去甲肾上腺素系统，乙酰胆碱系统，多巴胺系统等神经递质系统及记忆和神经适应性的功能有关。

    人群相关性分析，是在一定人群中设置患者组和对照组，研究某一遗传标记在两组中分配的不同。这种方法简单易行，不需设定遗传方式。以前对复杂性疾病如精神分裂症，狂躁抑郁症等精神疾病做了很多努力去寻找其连锁基因，但未成功，现在认识到是由于这些症状是受多基因作用的而非单个或少数基因作用的。计算机模拟分析显示对超过4-6个基因引起的疾病进行连锁分析的效力大为减弱。因此对复杂的多基因作用的疾病如药物滥用，相关性分析是比较适用有效的方法。如果易感基因和遗传标记处于连锁不平衡，则患者组中的遗传标记的频率将高于对照组。本文通过对海洛因依赖者及其同胞的9、10和11号染色体的基因组扫描发现D9S286，D9S167，D9S164和 D10S208，D10S196，D10S185，D10S1693位点的一个等位基因在海洛因依赖组中比例明显高于同胞对照组，提示这些位点附近可能存在海洛因依赖的易感基因。在初步确定的遗传标记周围选择间距更小的遗传标记再次扫描可更为精确地定位。在NCBI网站Genome数据库[4]检索距离遗传标记为5Mbp范围内的基因，D9S286位点附近有INSL6，INSL4基因，属于胰岛素样生长因子基因家族；D9S167位点附近有NTRT2基因，属于酪氨酸激酶受体基因家族；D9S164位点附近有多巴胺β-羟化酶（dopamine beta-hydroxylase，DBH）基因；D10S208附近有RAB18基因，属于小分子G蛋白Ras原癌基因家族; D10S196附近有PRGK1基因，编码cGMP依赖的蛋白激酶1，与细胞信号转导有关，SLC18A3和CHAT基因，与乙酰胆碱的转运和合成有关；D10S185位点附近有PDE6C基因编码cGMP敏感的磷酸二脂酶α亚基及细胞色素P450基因家族CYP26A1，CYP2C8，CYP2C9和CYP2C19基因；D10S1693位点附近有α2A ，β1和GFRA1基因及SLC18A2基因编码囊泡单胺转运体VMAT2，这些基因都可能与海洛因依赖的易感性有关。

    NTRT2（neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 2)基因编码酪氨酸激酶trkB，是神经营养因子BDNF和NTF3的受体。动物实验发现吗啡慢性处理大鼠后蓝斑核中BDNF和NTF3 mRNA增加，戒断时BDNF的表达持续增加，NTF-3的表达是延迟性增加，而且trkB，trkC的表达均增加。GFRA1基因编码神经营养因子GDNF受体α1 亚型。本实验室用反义寡核苷酸技术证实GDNF参与吗啡依赖和戒断，吗啡慢性处理大鼠后脊髓中GDNF、GDNFRα和GDNFRβ的mRNA均增加，脑干中GDNF表达增加，戒断时脊髓、脑干和前脑皮层中的表达均先下降后增加并持续高水平[5]。提示吗啡戒断反应可能引起神经元适应，神经营养因子及其受体参与这一变化。NTRT2基因和GFRA1基因有可能作为海洛因依赖易感的候选基因。

    DBH基因编码多巴胺β-羟化酶，多巴胺经DBH羟化后生成去甲肾上腺素，当神经冲动到达时DBH与囊泡内其它内容物一起释放。交感神经元的活动水平持续增高时，DBH基因mRNA明显增加，DBH合成增加。神经母瘤细胞SH-SY5Y经乙醇慢性处理后DBH mRNA及蛋白水平都增加，细胞释放的去甲肾上腺素也明显增加[6]。有报道DBH基因多态性同吸烟量相关，具有1368G/G基因型的吸烟者的每天吸烟量比具有G/A和A/A基因型的吸烟者少[7]。胞浆或脑脊液中低水平的DBH与某些精神疾病的易感性相关，Cubells等研究发现DBH基因的两个位点的多态性与胞浆DBH水平相关，而与低的DBH水平相关的单体型同可卡因诱发的偏执狂症状呈显著相关[8]。海洛因戒断症状主要表现为去甲肾上腺素能和胆碱能神经系统的功能紊乱，中脑边缘多巴胺能神经作为正性强化系统，蓝斑核去甲肾上腺素能神经作为负性强化系统参与海洛因依赖过程，DBH的水平可能影响多巴胺和去甲肾上腺素这两种神经递质水平，故DBH基因可以作为海洛因依赖易感的候选基因进行深入地研究。

    SLC18A3基因编码囊泡乙酰胆碱转运体VAChT，CHAT基因编码胆碱乙酰转移酶ChAT，这两个基因位点相连且基因的表达是共调控的。已发现CHAT基因有多种突变型，有三种突变型显著降低ChAT的表达，有一种突变型编码的酶几近无活性，有八种突变型编码的酶活性大为降低[9]。CHAT基因的突变型是否与海洛因依赖易感性有关呢，还有待今后继续研究。

    参考文献:

    1. 韩玲玲,杨国栋.药物依赖中的遗传因素.中国药物滥用防治杂志,2000,1:2-6.

    2. 周文华,杨国栋.药物滥用的易感性.中国药物依赖性通报,1998,7(1):1-5.

    3. 罗星光.阿片类物质依赖分子遗传学研究进展.国外医学遗传学分册, 2000, 23(6):315-7.

    4. http://www.ncbi.nlm.nih.gov

    5. 周文华,刘惠芬,谢小虎,等. 吗啡戒断大鼠脊髓和脑干以及前脑皮层胶质细胞源性神经营养因子及受体mRNA的表达。中华医学杂志,2000,80(2),135-9.

    6. Thibault C, Lai C, Wilke N,et al. Expression profiling of neural cells reveals specific patterns of ethanol-responsive gene expression.Mol Pharmacol, 2000,58(6):1593-600.

    7. McKinney EF, Walton RT, Yudkin P,et al. Association between polymorphisms in dopamine metabolic enzymes and tobacco consumption in smokers. Pharmacogenetics,2000,10(6):483-91.

    8. Cubells JF, Kranzler HR, McCance-Katz E,et al. A haplotype at the DBH locus, associated with low plasma dopamine beta-hydroxylase activity, also associates with cocaine-induced paranoia. Mol Psychiatry, 2000,5(1):56-63.

    9. Ohno K,Tsujino A,Brengman JM,et al. Choline acetyltransferase mutations cause myasthenic syndrome associated with episodic apnea in humans. Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(4)2017-22.