［摘要］目的：研究海洛因依赖者全血血小板膜粘附分子表达的变化及L 一精胺酸／环鸟普酸（cGMP ）体外作用的影响。 方法：应用流式细胞仪检测海洛因依赖者不同滥用方式全血血小板膜cD4 ，和cD62P 的表达，并体外应用L 一精胺酸、cGMP ，观察对此二者表达的影响。结果：海洛因依赖者静脉注射组、烫吸组血小板膜粘附分子表达均较正常人为高（P < 001 ) ，其中静脉注射组表达最高，而L一精胺酸、cGMP 能明显降低其表达（P < 001 ) ，且二者作用无显著差别。结论：海洛因依赖者血小板膜粘附分子表达可能高于正常人，通过L 一精胺酪NocGMP 途径可降低血小板膜粘附分子的表达，从而抑制血小板活化。

    ［关键词］海洛因依赖；血小板膜粘附分子；L 一精胺酸；环鸟普酸

    海洛因依赖可对机体造成广泛的影响，其中可能引起血小板功能的改变，而有关该方面的报道较少。我们对35 例海洛因依赖者进行治疗前后血小板膜粘附分子检测，并与正常人相对照，现将检测结果分析对比如下。

1 资料与方法

    1 . 1 临床资料

    根据DsM 一哪可片类药物依赖性诊断标准，结合病史和尿样检查确定人选病例：有海洛因滥用史，时间超过6 个月；尿液微量吗啡检测阳性；有明显的戒断症状；排除过敏及严重心、肝、肾功能损害者。选择自愿来我院戒毒治疗的海洛因成瘾者35 例，其中男性31 例，女性4 例，平均年龄( 23 . 21 乃．65 ）岁；平均吸毒时间（19 . 32 士7 . 35 ）个月，平均每日海洛因用量为（l . 01 士0 . 49 ) 9 。吸毒方式：烫吸16 例，静脉注射19 例。正常对照组巧例健康体检者，男7 例，女8 例，平均年龄（26 . 21 士4 . 79 ）岁。经体格检查都未发现有心、肝、肾、内分泌及代谢紊乱等疾病。

    1 . 2 试剂及材料
   
    兔抗人纤维蛋白原单克隆抗体（。ne 公司），抗人CM 卜140 单克隆（sigma 公司）, 异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠IgG ( mFIFG IgG ）、异硫氰酸荧光素标记的羊抗兔19 G ( rFIFoIgG ) （均购自华美生物工程公司），上述四种抗体均按1 : 5 用HEPEs 缓冲液稀释，纯化小鼠IgG （北京天象人生物技术有限公司）用卜10 HEPEs 缓冲液稀释。凝血酶、二磷酸腺普（A DP ）、HEPES （均购自sigma 公司）。主要仪器：EPIcs ELITE 型流式细胞仪、流式细胞仪专用测定管（。ulter 公司）。wsz - 133 一26 电热恒温水浴箱（上海护南科学仪器联营仪器厂）。

    1 . 3 测定方法

    清晨空腹时抽取健康志愿者及海洛因依赖者静脉血3 ml ,取后1 ml 置硅化试管中,以3. 8 %的柠檬酸钠(1 ∶9 , V/ V)抗凝,取自然沉降的富血小板血浆( PRP) ,1 ～5 号流式细胞仪测试管分别加入50 μl HEPES 缓冲液,1 号管加5 μl 纯化小鼠Ig G,2 ～7 号管各加兔抗人纤维蛋白原单克隆抗体10 μl ,8 ～13 号管加入抗人GMP 2 140 单克隆抗体10 μl ,然后各加入5 μl PRP ,10 min 后4 ～5 号管各加入10 μl L 2 精氨酸,6 ～7 号管各加入10 μl 8 2Br 2 c GMP ,10 ～11 号管各加入10 μl L 2 精氨酸,12 ～13 号管各加入10 μl 8 2 Br 2 c GMP ,静置20 min ,分别在2 、4 、6 、8 、10 、12 号管加入0. 5 U 凝血酶5 μl , 3 、5 、7 、9 、11 、13 号管分别加入1 mmol/ L ADP 0. 5 μl ,37 ℃温浴避光反应20 min 。2 ～7 号管再各加r FIFC 2 Ig G 10 μl , 8 ～13 管各加入mFIFC 2 Ig G 10μl ,然后1 ～13 号管各加入0. 2 %福尔马林1 ml ,温浴避光反应20 min ,上机检测,每个样本收集5 000个血小板，检测阳性血小板数目。

    1 . 4 统计学分析数据

    统计学分析 数据以均数±标准差( – x ±s)表示,采用t 检验及方差分析。

2 结果

    2 . 1 在各种刺激物作用下，海洛因依赖者全血血小板cD41 表达的改变cD41 的表达以流式细胞仪检测的阳性血小板百分数表示。结果表明，正常对照组cD41 的表达很低，烫吸组次之，静脉注射组的表达则最高（p＜0 . 01 或p＜0 . 05 ）。经方差分析，静脉注射各亚组和烫吸各亚组中，在各种刺激物作用下cD62P 表达有差异，其中以T 刺激与A 刺激表达上存在非常显著性差异（p＜0 . 01 ) ；在海洛因各组中A 或T 刺激下再加人L 或c 与加人单独T 刺激或A 刺激，其表达显著降低（p＜0 . 01 ) （其中A 代表二磷酸腺普，T 代表凝血酶，L 代表L 一精胺酸，c 代表8一Br-cCMP，下同）

    2 . 2 在各种刺激物作用下海洛因依赖者全血血小板CD62P 表达的改变CD62P 的表达以流式细胞仪检测的阳性血小板百分数表示。结果表明，正常对照组cD6 : P 的表达很低，烫吸组次之，静脉注射组的表达则最高（p＜0 . 01 或p＜0 . 05 ）。经方差分析，静脉注射各亚组和烫吸各亚组中，在各种刺激物作用下cD62P 表达有差异，其中以T 刺激与A 刺激表达上存在非常显著性差异（p＜0 . 01 ) ；在海洛因各组中A 或T 刺激下再加入L 或C 与单独加人T 刺激或A 刺激，其表达显著降低（p＜0 . 01 )  。

3 讨论

    cD62P 也称p-选择素，是目前最具特征的血小板活化的分子标志物，它具有介导活化血小板或内皮细胞与中性粒细胞及单核细胞粘附的功能，可使血小板与中性粒细胞粘附、聚集，形成血栓，故cD62P 在血小板活化，启动及扩大血栓形成中具有重要意义。血小板活化时，血小板内及隐蔽状态的GPlllb 、且a 复合物在膜表面得以暴露，其周围微环境或其构型发生改变，产生受体活性，能与多种粘附蛋白结合，其中由于血小板膜Fg 具有对称重复结构，可作为两个血小板之间的特梁”，故活化血小板与纤维蛋白原的结合为血小板聚集的重要基础。cD41 是糖蛋白Ⅱb 2 Ⅲa ( GP Ⅱb 2 Ⅲa)受体的亚基，GP Ⅱb-Ⅲa是纤维蛋白原受体，只有当血小板被活化时，血浆中的纤维蛋白原才能与血小板结合，同时GP Ⅱb-Ⅲa与血浆或组织中的一些粘附蛋白结合，这些蛋白包括纤维结合蛋白( fibronectin)、vit 2 ronectin 和vW 因子等，介导血小板聚集，这一控制功能是通过GPⅡb-Ⅲa的功能状态得以实现的。

    本文结果表明，正常人血小板表面cD41 、cD62P 分子数的表达水平很低，但海洛因依赖者外周血血小板cD41 、cD62P 含量显著高于正常人，显示海洛因依赖者血小板活化程度增加，血小板聚集性增强。其原因一方面考虑到与海洛因本身的毒性有关，还与毒品杂质、卷烟焦油、尼古丁等物质的作用有关，对静脉用毒的依赖者而言，反复的血管刺激，并可引起外周血管感染，触发炎症介质的释放，这些因素均使海洛因依赖者血管活性物质释放，血小板活化程度增加，血小板聚集性增强。

    现已知L 一精氨酸在Nos 催化下生成L 一肌氨酸和No , No 作为鸟普酸环化酶（guanylate cyclase , Gc ）的内源性活化因子，促进cCMP 合成，进一步作用于cCMP 门控离子通道、cCMP 调节磷酸二醋酶、cCMP 依赖蛋白激酶等效应靶蛋白，形成NocCMP 信号转导通路，调节血小板聚集，心肌和平滑肌收缩等重要的生理过程，甚至使已聚集的血小板解聚。这与我们观察到L一精氨酸、cCMP 对凝血酶活化的全血血小板膜粘附分子cD41 和cD6 : P 的表达育抑制作用相一致。此外，研究发现凝血酶较ADP 更能促进此两粘附分子的表达，这可能与凝血酶为强的血小板激动剂，ADP 为弱的激动剂有关，而两者浓度梯度无显著差异。