摘　要　目的：研究一氧化氮合酶(NOS)抑制剂N-硝基-L-精氨酸(LNNA)对吗啡依赖小鼠催促戒断反应的治疗作用。方法：采用小鼠戒断模型，观察不同给药途径(ip和ig)，不同剂量的LNNA对吗啡依赖小鼠戒断综合症的治疗效果。结果：NOS抑制剂LNNA可明显延长戒断小鼠跳跃潜伏期，减少小鼠的戒断跳跃反应次数，且抑制其腹泻症状。结论：NOS抑制剂LNNA可延缓吗啡耐受。

　　近年国外研究发现，吗啡类药物依赖及耐受与NMDA/NO系统有关^［1］。国外有报道指出^［2］,腹腔注射一氧化氮合酶(Nitric Wxide Synthace,NOS)抑制剂可对抗小鼠对阿片类药物的依赖，同时，NOS抑制剂与吗啡合用时能降低吗啡耐受，国内目前尚无该方面的报道。本文采用小鼠吗啡依赖模型，对N^G-硝基-L-精氨酸(LNNA)治疗戒断反应及吗啡镇痛耐受性的效果进行研究，为寻找一条新的阿片类药物依赖治疗途径打下基础。

　　1　材料与方法

　　1.1　动物　昆明种小鼠，♀♂兼用，体重18g～22g，中国科学院昆明动物研究所提供(动物合格证号 滇实动证第9712号)。

　　1.2　药品　吗啡（中国药品生物制品检定所，批号 1201-9612)，临用时以0.1mol·L^-1的HCl溶解后，再用生理盐水稀释至所需浓度，pH为6～7；LNNA（美国Sigma公司，批号 A011150101）；盐酸纳洛酮原料药（军事医学科学院毒物药物研究所提供)。

　　1.3　吗啡耐受实验模型的建立　取♀性昆明种小鼠于55℃±1℃的热板上测定初痛阈，将初痛阈低于5s或超过30s的小鼠剔除。合格小鼠随机分为3组，每组8只。对照组每天sc 5mg·kg^-1吗啡，同时ip生理盐水。治疗组在给予吗啡的同时，分别 ip 2、4mg·kg^-1LNNA。每日给吗啡30min后测痛阈，共测5d。

　　1.4　吗啡依赖模型的建立　采用小剂量递增法^［3］吗啡剂量从25mg·kg^-1增至150mg·kg^-1，sc 4.5d，经纳洛酮(5mg·kg^-1)催瘾后，跳跃反应率为100%的小鼠为理想的小鼠吗啡依赖模型。

　　1.5　实验方法　(1)LNNA ip 实验组　昆明种小鼠45只，按体重均衡原则随机分为5组，每组9只。吗啡对照组：每天sc吗啡，于催瘾前30min ip生理盐水；LNNA ip (Ⅰ)组分3小组：每天sc吗啡和LNNA ip 4mg·kg^-1，分两次给药。ip LNNA(Ⅱ)组：每天sc吗啡，于催瘾前30min ip LNNA，剂量分别为2、4、8mg·kg^-1。(2)LNNA ig 治疗组　昆明种小鼠32只，♀♂兼用，按体重均衡原则随机分为4组，每组8只。吗啡对照组：每天sc吗啡，于催瘾前1h ig 0.5%西黄氏胶。LNNA ig 实验组：每天sc吗啡，于催瘾前1h ig LNNA，剂量分别为2、4、8mg·kg^-1。

　　各组小鼠于末次注射后6h，ip 5mg·kg^-1纳洛酮催瘾，记录20min内小鼠的跳跃反应数，戒断前后1h内的体重变化，跳跃潜伏期及腹泻等症状。1h后称重并处死对照组和每日 ip LNNA(4mg·kg^-1)组小鼠，取出脾脏和胸腺称重并与生理盐水组比较。各数据进行t检验。

　　1.6　NO合酶抑制剂LNNA急性毒性实验　昆明种小鼠16只，♀♂兼用，按体重均衡原则随机分组，每组8只。LNNA ig实验组：给药剂量为2 000mg·kg^-1。尾静脉注射LNNA实验组：用75%的酒精棉球擦小鼠尾，扩张尾静脉，经尾静脉注射37.5mg·kg^-1的LNNA。两组小鼠给药后观察7d，记录动物死亡数。

　　2　实验结果

　　2.1　LNNA对吗啡耐受性的影响　单独给吗啡对照组，sc吗啡第1d出现明显镇痛作用，连续注射给药，吗啡镇痛作用下降，至第5d，已无镇痛作用。LNNA ip 2、4mg·kg^-1组，在给药第1d，吗啡有明显镇痛作用，至第5d，吗啡仍有镇痛作用，4mg·kg^-1剂量组与单独给吗啡组比较有显著性差异(P＜0.05)，而两高低剂量组之间无显著性差异。

表1　N^G-硝基-L-精氨酸(LNNA)对吗啡耐受性的影响(n=9)

　　注：与实验前比较，^bP＜0.05,^dP＜0.001;与吗啡对照组比较，^eP＞0.05,^fP＜0.05

　　2.2　LNNA对吗啡依赖小鼠戒断症状的影响　腹腔注射LNNA (Ⅰ)组与对照组比较，LNNA可抑制小鼠体重下降及跳跃反应，但对跳跃潜伏期无显著性影响。LNNA (Ⅱ)组与对照组比较，2mg·kg^-1剂量组对戒断症状无影响。而4、8mg·kg^-1剂量组可明显抑制体重下降及跳跃反应次数，并延长跳跃潜伏期，且8mg·kg^-1剂量组的作用明显强于4mg·kg^-1剂量组。除此之外，LNNA还对腹泻有治疗作用。经纳洛酮催瘾后，对照组腹泻症状明显，而ip LNNA可抑制小鼠的腹泻症状，8mg·kg^-1剂量组可明显抑制小鼠腹泻症状(P＜0.05)，结果见表2。

表2　腹腔注射LNNA对小鼠戒断症状的影响(n=9)

　　注：与吗啡对照组比较，^bP＜0.05,^cP＜0.01,^dP＜0.001

　　将LNNA(Ⅰ)组和吗啡对照组动物于催瘾1h后处死，取脾脏、胸腺称重，按公式脾脏(胸腺)指数=脾脏(胸腺)重量/体重，计算其指数，并与生理盐水组比较。两组的胸腺指数与生理盐水组相比有显著性差异，而脾脏指数无显著性差异，结果见表3。

表3　吗啡和LNNA对小鼠脾脏 胸腺重量的影响(n=9)

　　注：与NS组比较，^bP＜0.05

　　2.3　LNNA对小鼠戒断症状的影响　腹腔注射给予2.0、4.0和8.0mg·kg^-13个不同剂量的LNNA治疗后，3个剂量均可抑制催促戒断后小鼠体重下降；2mg·kg^-1LNNA对小鼠的跳跃反应无明显抑制作用，4、8mg·kg^-1LNNA则可极显著地抑制小鼠的跳跃反应。3个剂量均可极显著地延长小鼠的跳跃潜伏期(P＜0.01;P＜0.001)，并抑制腹泻症状的发生。结果见表4。

表4　LNNA对小鼠戒断症状的影响(n=8)

　　注：与吗啡对照组比较,^bP＜0.05,^cP＜0.01,^dP＜0.001

　　2.4　LNNA急性毒性实验　两组动物分别尾静脉注射37.5mg·kg^-1和 ig 2 000mg·kg^-1LNNA，给药后观察7d，7d内小鼠生长正常，活动自如，无死亡。

　　3　讨　论

　　本实验采用吗啡建立了标准的成瘾模型，经纳洛酮催瘾后，小鼠表现出明显的跳跃反应和腹泻症状，证明依赖模型是成功的。通过吗啡对照组和LNNA治疗组戒断症状的比较，发现发生跳跃反应多的动物，其腹泻机会亦多。从表2可见，对照组跳跃动物数为100%，腹泻动物数为66.7%；而治疗组(8mg·kg^-1)跳跃动物数只有33.3%，腹泻动物数为零。在表3中，对照组中跳跃动物数高的腹泻发生率均高，为100%，而治疗组，两者都下降。可见，跳跃反应和腹泻是戒断反应的重要指标。从表2、表3可见，实验建立了理想的成瘾模型，在此模型上本实验进行了NOS抑制剂LNNA对吗啡耐受及依赖形成的影响。LNNA属于L-精氨酸同类物。L-精氨酸是合成NO的底物，LNNA通过竟争性占领L-精氨酸的结合部位，抑制NO合成。近年来研究表明^［1］，NO可能介导了吗啡的镇痛作用、免疫调节以及增加脑局部血流和戒断反应等多种作用。可见抑制NO合成，可影响吗啡戒断反应及吗啡镇痛作用。

　　有研究发现，NOS抑制剂本身在经典的镇痛实验中并无镇痛作用，但可阻止吗啡耐受性和依赖性的产生。Kolesnikov^［3］等采用不同给药方案及给予不同剂量的NOS抑制剂NO₂Arg进行了深入的研究，结果显示，NO₂Arg能延缓吗啡耐受且阻止吗啡依赖的产生。本实验结果同上述情况一致。NOS抑制剂具有延缓耐受性的作用，可能与抑制NO合成有关。因为NO参与了外周痛觉、脊髓及其以上水平的痛觉调制。同时，本实验对ip和ig两种给药方式的效果和剂量相关性进行了研究。两种给药途径的治疗效果无显著性差异(P＞0.05)，对吗啡依赖小鼠的戒断症状均有较好的抑制作用。在剂量相关性方面的研究显示，ip和ig给药都无剂量相关性，4mg·kg^-1与8mg·kg^-1具有相同效果，两剂量组之间无显著性差异(P＞0.05)。而国外有研究表明，NOS抑制剂的作用在2、4、8mg·kg^-1范围内具有剂量依赖性。存在此差异，可能是由于动物品种、实验条件、药品等之间有差异。

　　目前国内尚无关于NOS抑制剂毒性的研究，本实验在这方面进行了初步讨探。采用ig和尾静脉注射两种给药方式，LNNA ig的剂量为2 000mg·kg^-1，尾静脉注射剂量为37.5mg·kg^-1，结果表明LNNA毒性很小。而在实际运用中剂量极低，一般小鼠只需4～8mg·kg^-1。因而LNNA使用时比较安全。

　　本研究结果表明，NOS抑制剂LNNA用于阿片类药物依赖治疗有很好的应用前景。

　　作者简介：赵晶，女，理学博士，副主任药师。中国药学会医院药学专业委员会委员，全军新药审评委员会委员。

　　苏国丽，贵阳医学院实习学员。

　　参考文献：

　　1　钟慈声，孙安阳.一氧化氮的生物医学.第一版.上海：上海医科大学出版社，1997；213

　　2　刘屏，陈世铭，陈慧英等.钙拮抗剂抗胆碱药对吗啡依赖小鼠催促戒断症状的治疗作用.中国药物依赖性通报，1996;5（1）:16

　　3　Y. A.Kolesnirov，C. G.Pick，G.Ciszewska.et al.Blockade of tolerance to morphine but not to opioids by a nitric oxide synthase inhibitor.Proc.natl.Acod Sci USA,1993;90:5163

解放军药学学报 1999年第6期第15卷 论著

作者：赵晶　徐贵丽　苏国丽

单位：中国人民解放军成都军区昆明总医院　昆明　650032

关键词：N-硝基-L-精氨酸；吗啡；依赖；耐受；戒断症状