目的　观察吗啡依赖戒断时大鼠脊髓和脑干μ受体和κ受体mRNA表达以及毒蕈碱受体拮抗剂、NMDA受体拮抗剂和NOS抑制剂对这些基因表达的影响。方法　用逆转录聚合酶链反应（RT－PCR)，以β-actinmRNA为内标检测μ受体和κ受体mRNA的表达水平。结果　吗啡依赖大鼠脊髓和脑干μ受体mRNA表达明显升高，纳洛酮激发大鼠戒断反应1h后μ受体基因表达降低，4h后接近正常组,而脊髓和脑干κ受体基因的变化与μ受体基因表达趋势相反。鞘内注射PKA抑制剂Rp-cAMPs和蛋白磷酸酶抑制剂calyculinA可以明显减少脊髓和脑干中μ受体和κ受体基因表达，而PKA激活剂Sp-cAMPs则无明显影响；经NOS抑制剂l-N-硝基精氨酸甲酯(l-NAME)处理后，脊髓μ受体和κ受体基因表达明显减少，经毒蕈碱(M)受体拮抗剂甲基东莨菪碱处理后，脊髓μ受体和脑干κ受体基因表达也明显减少，而脊髓κ受体和脑干μ受体基因表达变化不明显；经NMDA拮抗剂MK801和M1受体拮抗剂哌拉唑嗪处理后，脊髓和脑干μ受体和κ受体基因表达较戒断1h组无明显差异。脊髓和脑干中β-actin基因表达各处理组之间没有差别。结论　吗啡依赖和戒断动物脊髓和脑干中μ受体和κ受体基因表达发生改变，M受体拮抗剂和NOS抑制剂在吗啡戒断反应时减少μ受体和κ受体基因表达可能是它们有效控制吗啡戒断症状的机制之一。

　　阿片受体介导了吗啡依赖和耐受过程，但不同的受体亚型在吗啡依赖过程中的神经生物学意义迄今尚未清楚。有报道阿片的身体依赖作用主要由μ受体介导，μ受体基因敲除小鼠对吗啡不产生镇痛作用，也失去位置偏爱及纳洛酮催促的戒断反应^[1]。最近，Simonia等通过κ受体缺失小鼠实验证实κ受体对内脏痛、低边缘运动和κ受体激动剂的镇痛和厌恶效应起了关键作用^[2]，而内源性κ受体激动剂不产生吗啡样镇痛，并可拮抗吗啡镇痛以及减轻戒断症状^[3]。在吗啡依赖和戒断过程中μ和κ受体的调节仍有不少争论。本实验室研究发现毒蕈碱(M)受体拮抗剂，NMDA受体拮抗剂和NOS抑制剂对动物吗啡戒断反应均有减轻作用^[4,5]，但它们对μ和κ阿片受体基因表达的影响迄今仍未见报道。本文采用RT－PCR方法检测吗啡依赖和戒断大鼠脊髓和脑干μ受体和κ受体mRNA表达，同时观察东莨菪碱，M1受体拮抗剂哌拉唑嗪，NMDA受体拮抗剂和NOS抑制剂处理后对这些基因表达的影响

　　1　材料和方法

　　1.1　试剂吗啡系沈阳制药厂产品（批号970701），纳洛酮，甲基东莨菪碱，哌拉唑嗪（pirenzepine），MK801，l-N-硝基精氨酸甲酯(l-N-Nitro-argininemethylester，l-NAME）系Sigma公司产品。Sp-cAMPs，Rp-cAMPs，calyculinA系RBI公司产品。总RNA提取试剂盒，RNA逆转录试剂盒均为Promega公司产品。PCR试剂盒，琼脂糖，PCRMarker系华美公司产品。DEPC系Fluka公司产品。其它试剂均为分析纯。

　　1.2　动物处理及分组♂，Sprague-Dawley大鼠由上海动物中心提供，体重(250±20)g。参照文献^[4]，大鼠皮下注射吗啡，首日10mg·kg－1(bid)，隔日每次增加10mg·kg^－1，至d6末次注射50mg·kg^－1，建立吗啡依赖模型，为吗啡依赖组，腹腔注射纳洛酮4mg·kg－1可激发戒断症状为吗啡戒断组。纳洛酮激发戒断症状1h、2h、4h后处死的大鼠分别为戒断1h组、戒断2h组、戒断4h组。在纳洛酮激发前30min腹腔注射MK801(0.125mg·kg^－1)、M1受体拮抗剂哌拉唑嗪(10mg·kg^－1)、甲基东莨菪碱（0.5mg·kg^－1)和NOS合酶抑制剂l-NAME（10mg·kg^－1），激发戒断症状1h处死的大鼠分别为MK801处理组、哌拉唑嗪处理组、甲基东莨菪碱处理组和l-NAME处理组。

　　1.3　大鼠脊髓鞘内慢性套管埋植大鼠经30mg·kg^－1戊巴比妥钠麻醉后，固定于立体定位仪(ABS产品)，经消毒分离枕骨大孔附近肌肉，经过寰枕膜缓缓插入充满生理盐水的PE10导管，终止于脊髓胸段。手术后，经过抗菌治疗和恢复5d后，开始建立吗啡依赖实验。在纳洛酮激发前30min，鞘内分别注射可透过细胞膜的蛋白激酶A的激活剂Sp-cAMPs（90nmol·kg^－1），可透过细胞膜的蛋白激酶A抑制剂Rp-cAMPs（90nmol·kg^－1）或者蛋白磷酸酶抑制剂calyculinA(100nmol·kg^－1)。激发戒断症状1h处死的大鼠为Sp-cAMPs处理组、Rp-cAMPs组和calyculinA处理组。

　　1.4　引物由上海生工生物工程公司合成，参照文献，三条引物序列分别为：μ受体^[6]：上游:5'TGTCCCACGTTGATGGCAAC3'，下游:5'AGGTTCTCCCAGTACCAGGT3'，扩增片段长598bp。κ受体^[7]：上游:5'ATACTACCACGGCTTGCTTC3'，下游:5'CTTCCCAAATCAGCGTCAGT3'，扩增片段长496bp。β-actin^[8]：上游引物：5'TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGTAAAG3'，下游引物：5'CCTAGAAGCATTTGCGGTGCACGATGGAGG3'，扩增片段长409bp。

　　1.5　总RNA提取大鼠断头处死，迅速分离取出脊髓和脑干约100mg，按试剂盒说明操作，得到RNA沉淀，用20μl无RNAase的水溶解，紫外分光光度计测定总RNA浓度，A260nm/A280nm为1.8～2.0，并用甲醛变性凝胶电泳鉴定质量。提取总RNA于－70℃保存。

　　1.6　逆转录和PCR反应取2μgRNA65℃变性3min后，加入反应缓冲液，总体积为20μl，包含Tris-HCl10mmol·L^－1，pH8.3，KCl50mmol·L^－1，TritonX-1000.1％，MgCl22.5mmol·L^－1，dNTPs0.2mmol·L^－1，DTT5mmol·L^－1，RNA酶抑制剂20U，AMV逆转录酶23U，oligo(dT)0.5μg。42℃反应60min，95℃5min终止反应，加水稀释至100μl。取逆转录反应液20μl，分别进行μ受体、κ受体和β-actin基因的PCR扩增。PCR反应液总体积为50μl，包含Tris-HCl10mmol·L^－1，pH8.3，KCl50mmol·L^－1，TritonX-1000.1％，MgCl21.5mmol·L^－1，dNTPs0.2mmol·L^－1，DTT5mmol·L^－1，上、下游引物各50pmol，95℃变性10min，加TaqDNA聚合酶2.5U，再覆盖石蜡油50μl，94℃变性3min后进行PCR循环（AMPLITRON公司PCR仪），条件为：94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min，完成35个循环后，72℃再延伸10min，置冰浴中。取10ulPCR产物在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，5V·cm^－1，50min，用自动成像仪（FOTODYNE公司）观察拍照。图谱进行扫描（STORM860）后计算各组μ受体或者κ受体与β-actin的面积比值。

　　1.7　统计学处理统计分析采应用t检验。

　　2　结果

　　2.1　吗啡依赖或戒断大鼠脊髓和脑干μ受体mRNA的表达提取的RNA作为逆转录反应的模板，以μ受体引物扩增出的片段长约600bp，与设计的μ受体扩增片段长598bp相一致。图1和图2所示，吗啡依赖大鼠脊髓和脑干中μ受体mRNA表达明显升高，纳洛酮激发大鼠戒断症状1h后表达减少，2h后脊髓和脑干中μ受体基因表达仍高于正常组，4h后接近正常组水平。鞘内注射PKA激动剂Sp-cAMPs后脊髓中μ受体基因表达较对照组轻度增加，PKA抑制剂Rp-cAMPs或蛋白磷酸酶抑制剂calyculinA处理后μ受体基因表达明显减少；经M受体拮抗剂甲基东莨菪碱(0.5mg·kg^－1)和NOS抑制剂l-NAME(10mg·kg^－1)处理后，脊髓μ受体基因表达都低于戒断1h组，经MNDA拮抗剂MK801和M1选择性受体拮抗剂哌拉唑嗪处理后，脊髓μ受体基因表达较戒断1h组没有明显变化。而脑干中只有calyculinA处理组μ受体基因表达较戒断组减少。各处理组中脊髓和脑干β-actin表达量没有差异(图1和图2)。根据重复实验的电泳图谱的扫描结果，计算各组的μ受体基因的产物面积与β-actin的面积之比，吗啡依赖组脊髓μ受体的相对表达量较正常对照组和戒断1h组有显著差异（P＜0.05）,Rp-cAMPs、calyculinA、甲基东莨菪碱和l-NAME处理组的表达量较戒断1h组明显减少（P＜0.01）；calyculinA处理组脑干μ受体基因相对表达量减少（P＜0.01）。

图1脊髓中β－actin、μ受体和κ受体RT－PCR产物电泳图

图2脑干中β－actin、μ受体和κ受体RT－PCR产物电泳

　　O：分子量标记；A：吗啡依赖组；B：对照组；C：吗啡1h戒断组；D：吗啡2h戒断组；E：吗啡4h戒断组；F：MK801处理组；G：哌拉唑嗪处理组；H：东莨菪碱处理组；I：l-NAME处理组；J：Sp-cAMPs处理组；K：Rp-cAMPs处理组；L：calyculinA处理组。上图：β-actin特异性RT-PCR产物带；中图：μ受体特异性RT-PCR产物带；下图：κ受体特异性RT-PCR产物带

　　2.2　吗啡依赖或戒断大鼠脊髓和脑干κ受体mRNA的表达以κ受体引物扩增出的片段长约500bp，与设计的κ受体扩增片段长498bp相一致。图1和图2显示，吗啡依赖时脊髓和脑干中κ受体基因较正常组减少，纳洛酮激发戒断反应后1h，脊髓和脑干中κ受体基因较正常组升高；而脊髓κ受体基因在纳洛酮激发戒断反应2h减少，4h后恢复到正常水平，脑干κ受体基因表达在2h和4h后明显减少。只有鞘内注射Rp-cAMPs组、calyculinA或者l-NAME处理组脊髓中κ受体基因表达明显减少，其它处理组κ受体基因表达与对照组没有差异；甲基东莨菪碱处理组、Sp-cAMPs、Rp-cAMPs和calyculinA处理组脑干κ受体基因表达明显减少，而MK801和哌拉唑嗪处理组脑干κ受体基因表达变化不明显。根据重复实验的电泳图谱的扫描结果，计算各组κ受体基因的产物面积与β-actin的面积之比，Rp-cAMPS、calyculinA和l-NAME处理组的κ受体基因的相对表达量较戒断1h组明显减少（P＜0.01）；Sp-cAMPs、Rp-cAMPs、calyculinA和甲基东莨菪碱处理组脑干κ受体相对表达量减少（P＜0.01）。

　　3　讨论

　　脊髓和脑干是介导吗啡戒断反应的主要部位，本文应用RT-PCR显示μ受体和κ受体在脊髓和脑干表达,μ受体的基因结构的上游调控区有cAMP反应蛋白结合的反应元件^[9]，细胞内PKA激活可能增加μ受体的表达，而细胞内cAMP升高及PKA激活显著降低κ受体mRNA水平^[10]。本文发现吗啡依赖时脊髓和脑干中μ受体mRNA表达增加及κ受体mRNA表达减少间接证实吗啡依赖时cAMP上调和PKA激活。从吗啡依赖以及纳洛酮激发戒断反应的时相分析来看，在脊髓和脑干中μ受体表达量的变化趋势与κ受体表达相反。阿片受体的身体依赖作用主要由μ受体介导，μ受体基因敲除动物对吗啡不产生镇痛作用，也失去位置偏爱及纳洛酮催促的戒断症状^[1]，内源性κ受体激动剂可以减轻戒断症状，主要介导戒断后的厌恶^[3]。纳洛酮激发戒断症状的高峰时间约半小时，在注射纳洛酮后1hκ受体mRNA表达增加可能参与了吗啡戒断反应时的恶劣心境，调节的结果，可能还涉及其它激酶系统。

　　NOS抑制剂，NMDA受体拮抗剂和胆碱能受体拮抗剂可以减轻吗啡镇痛耐受和抑制吗啡戒断反应^[4,5]。在纳洛酮激发前30min注射NOS抑制剂l-NAME质和M受体拮抗剂甲基东莨菪碱均可明显减少吗啡戒断症状，只有甲基东莨菪碱和l-NAME处理后脊髓中μ受体和κ受体表达明显受到抑制，而MK-801和哌拉唑嗪处理组对它们的表达没有影响。尽管毒蕈碱受体、NMDA受体以及NO信息途径均参与吗啡依赖过程，从调节μ受体和κ受体mRNA的转录来看它们是通过不同的信息转导途径来介导的。l-NAME系NOS抑制剂，处理后对μ受体和κ受体表达明显抑制，由于NMDA和选择性M1受体抑制剂并不影响阿片受体表达，提示NO系统对于阿片受体表达可能通过其它途径调节。本实验室发现M受体可能通过蛋白磷酸酶途径参与吗啡依赖和戒断，本文发现东茛菪碱和蛋白磷酸酶抑制剂对于μ受体和κ受体的调节是一致的。从构建的细胞株表达体系发现κ受体的去敏感是同系调节，主要发生在受体自身水平；而μ受体的去敏感是异系调节，导致多种受体后的信息转导途径改变^[12]。从脑干结果显示，各处理组中只有东茛菪碱和蛋白磷酸酶抑制剂具有抑制μ受体表达，而东茛菪碱、PKA激动剂、抑制剂或者蛋白磷酸酶抑制剂处理后κ受体表达均减少，这种差异反映了阿片受体亚型转录机制上的不同。阿片受体的表达只是反映阿片功能的一个调节环节，基因表达水平的改变尚不能完全解释吗啡依赖的神经生物学机制。而且考虑到多种神经递质系统的上行系统和下行系统均同时影响到脊髓和脑干神经元功能，毒蕈碱受体和NO系统对于μ受体和κ受体的转录有调节作用，可能是其控制吗啡戒断反应的机制之一。

　　本课题由浙江省医药卫生科研项目(980A093)和国家科技部科技攻关项目(94Z05)资助。

　　刘惠芬,女,助理研究员.主要从事分子生物学研究。杨国栋,男,研究员,从事阿片依赖的机制和防治研究。

　　参考文献

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　　2，Matthes HW，Maldonado R，Simonin F，et al.Loss of morphine-induces analgesia，reward effect and withdrawal symptoms in mice lacking the mu-opi-oid-receptor gene.Nature,1996；383:819

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　　4，杨国栋，周文华，张富强,等.选择性毒蕈碱受体拮抗剂减轻吗啡耐受和依赖的实验研究.中华医学杂志，1997；77:130

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　　6，Wang JB，Imai Y，Epler MC，et al.Mu opiate re-ceptor cDNA cloning and expression.Proc Natl Acad Sci USA,1993；90:10230

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　　8，Tokunaga K，Taniguchi H，Yoda K,et al.Nu-cleotide sequence of a full-length cDNA for mouse cytoskeletal beta-actin mRNA.Nucleic Acids Res，1986；14:2829

　　9，Wendel B,Hoehe MR.The human mu opioid recep-tor gene:5'regulatory and intronic sequence.J Mol Med,1998;76:525

　　10，Tryoen Toth P，Gaveriaux Ruff C，Maderspach K,et al.Regulation of kappa-opioid receptor mRNA level by cyclic AMP and growth factors in cultured rat glial cells.Brain Res Mol Brain Res,1998；55(1):141

　　11，Pitcher JA,Payne ES,Csortos C,et al.The G pro-tein-coupled recetor phosphatase:a protein phos-phatase type 2A with a distinct subdellular distribution and substrate specificity.Proc Natl Acad Sci USA,1995;92:8343

　　12，Tallent M,Dichter MA,Reisine T.Differential reg-ulation of the cloned kappa and mu opioid receptors.Neurosci,1998;85:873

中国临床药理学与治疗学 2000年第1期第5卷 论著

作者：周文华　刘惠芬　谢小虎　杨国栋

单位：文华(宁波微循环与莨菪类药研究所，宁波　315010)；刘惠芬　谢小虎　杨国栋(宁波戒毒研究中心)

关键词：吗啡；戒断反应；μ受体；κ受体；毒蕈碱受体；NMDA