摘要 目的: 研究吗啡急性给药、吗啡依赖及戒断对大鼠心脏心钠素基因表达的影响。方法：利用斑点及Northern杂交技术检测大鼠心房的心房钠利尿因子信使RNA（ANF－mRNA）含量。结果： 吗啡急性给药、吗啡依赖及戒断时大鼠心房ANF－mRNA含量均升高。结论： 吗啡急性给药、吗啡依赖及戒断时大鼠心脏心钠素基因表达均增强。
    关键词 吗啡； 心钠素； 基因表达

    吗啡依赖及戒断的产生机理十分复杂,至今尚无确切定论。但关于吗啡依赖和戒断时机体各系统发生的多种变化已有很多报道,其中尤以神经内分泌系统的变化最受关注[1－3] 。心钠素是近年被发现的由心脏分泌的一种具有调节水盐代谢、血压、血容量的一种重要激素,其释放和贮存受多种因素影响。有文献报道,急性静脉注射(iv)吗啡，能迅速引起大鼠血浆心钠素的明显增高[4] 。本文利用核酸分子杂交技术研究了急性腹腔注射(ip)吗啡、吗啡依赖及由纳洛酮引起吗啡戒断时大鼠心房心钠素基因表达的变化情况。同时利用火焰光度法测定了血清钠在以上各阶段的变化,并探讨了血钠与心房心钠素基因表达变化的可能关系。

1 材料和方法
1.1 实验材料 
正常♀Wistar大鼠,体重160－220 g,吉林大学动物部提供。
1.2 主要实验药物及试剂
盐酸吗啡：沈阳第一制药厂生产,批号：961002,盐酸纳洛酮：北京四环制药厂生产,批号：9610112,载有大鼠心房钠利尿因子互补DNA（ANF－cDNA）的质粒pNI－11由洪敏教授在加拿大Laval大学克隆,α－32P标记的胞嘧啶脱氧核糖三磷酸（α－32P－dCTP），北京亚辉公司提供,随机引物标记探针套件,美国Promega公司提供。
1.3实验方法
1.3.1动物分组与处理 将28只大鼠随机分成4组,每组7只。 对照组： 前7 d每日2次(8:00及20:00 )ip生理盐水(体积与当日注射吗啡相同)；d8、10、14每日一次ip生理盐水(体积与当日注射纳洛酮相同),d14与最后一组大鼠同时处死。吗啡急性给药组:d1,ip盐酸吗啡2次(8:00及 20:00),日剂量为 20 mg·kg－1,次日20:00处死;吗啡依赖组：每日2次(8:00及20:00)ip盐酸吗啡,日剂量为d1、d2 20 mg·kg－1,d3 40 mg·kg－1, d4 60 mg·kg－1, d5 80 mg·kg－1,d6 90 mg·kg－1, d7 100 mg·kg－1,d8早6:00处死；吗啡戒断组：前7 d处理与吗啡依赖组相同；d8、10、14每日一次(7:30)ip 4 mg·kg－1纳洛酮催促，并于最后一次催促后即刻处死。
1.3.2火焰光度法测定血清钠
1.3.3心钠素基因表达研究有关实验[5] 各组大鼠处死后留取心房，提取组织总RNA,分别进行斑点及Northern印迹,用[α－32P]标记的大鼠心钠素前体源c－DNA探针与心房印迹进行斑点及Northern杂交。
1.3.4 统计学方法及密度扫描结果处理 所有数据均以x ±s表示，并经方差齐性分析,利用t检验进行组间显著性分析。密度扫描以对照组密度为100％,各实验组与之比较而得出相对密度值。

2 结果
2.1吗啡依赖及戒断大鼠血清钠
    从表1中可以看出:急性ip吗啡24 h后, 血清钠浓度明显高于对照组大鼠(P<0.01)；连续ip吗啡7 d后,血清钠浓度进一步升高(P<0.001)；停用吗啡并用纳洛酮连续催促3次后,仍高于对照组,但已明显低于注射吗啡24 h及7 d后的浓度。
2.2 大鼠心钠素基因表达情况
    从图1 可以看出RNA转移电泳杂交实验中,杂交信号出现在18 s RNA之前,经计算,r－ANF－ mRNA长度约在1000碱基。此次结果与以往报告相同。而且肯定了斑点杂交实验中杂交信号的特异性。从图1－4可以看出, 心房心钠素基因表达在ip吗啡24 h后,略高于对照组；连续使用吗啡7 d后则明显升高;纳洛酮催促3次后,较使用吗啡7 d后有所下降,但仍明显高于对照组。

3 讨论
    文献报道, iv吗啡10 min内即可引起大鼠血清心钠素增加8－10倍[4],其机制尚不清楚。从本实验分子杂交结果可见,大鼠ip吗啡24 h后,心房心钠素mRNA水平即增高,表明吗啡的使用已从基因水平引起大鼠心房心钠素的合成增加。心房心钠素的合成和释放受多种因素影响,心房的牵张刺激和血容量的增加,能直接引起心房释放心钠素的增加[6] 。受体分析实验证明大鼠心肌细胞膜上存在着κ阿片受体，阿片样物质对心肌具有抑制作用,使心肌收缩减弱[7],这样可能造成心房内血容量的增加,引起心房压的增高而使心房肌受到牵张刺激,引起心房释放心钠素明显增多；这很可能是急性使用吗啡引起血浆心钠素水平明显增加的原因之一。此外，也不应排除下列可能,即阿片样物质与心肌细胞膜上受体结合,通过细胞内信号传递系统直接引起心肌细胞内内质网释放心钠素的增加。另外,血钠升高也是刺激心房释放心钠素的有效因素之一,从本实验结果可以看到,ip吗啡24 h后,大鼠血清钠浓度明显升高,可能也是吗啡引起血浆心钠素水平升高的原因。
    有文献报道,当慢性给予吗啡刺激时,大鼠血浆心钠素水平反而有所下降,这可能与心房对吗啡的作用产生耐受有关。而从本实验结果可以看到,连续7 d给大鼠ip吗啡后,心房心钠素mRNA水平明显高于ip吗啡24 h时的大鼠,这可能是对前期心钠素大量释放的一种代偿性反应。结合本实验血清钠测定结果可见,大鼠连续7 d ip吗啡后，血钠比注射吗啡24 h时又有明显增加,因此推断大鼠被注射吗啡期间,血钠可能呈不断升高趋势。这将不断刺激心房释放大量的心钠素入血,也使心房心钠素基因表达不断增强,以适应机体对心钠素的需求。但若前期释放过多,即使合成增加也可能出现后期血中心钠素水平下降现象。
    在实验过程中我们观察发现,停用吗啡并用纳洛酮催促后,大鼠进食进水量急剧减少,并且由于戒断而频繁腹泻,这必然会引起戒断大鼠血容量的明显减少（这一点在后期收集血液时得到了证实）。从血钠测定结果看,戒断后血钠也迅速下降,按以上分析推测,此时大鼠心房心钠素合成和释放应明显减弱。但本实验的事实是,戒断大鼠心房心钠素mRNA水平仍明显高于对照组,仅略低于注射吗啡7 d时。这提示,除上述提及的血钠升高等因素外,还有其它能刺激心房合成、释放心钠素的因素存在。文献报道,戒断大鼠体内激素水平的变化与机体在应激状态下的变化非常相似,皮质酮、血管紧张素、ACTH等均显著升高[7] ,而这些激素恰恰能高效刺激心钠素的合成和分泌。
    通过上述分析我们看到,在急性吗啡刺激、吗啡依赖及戒断过程中,大鼠心房心钠素的基因表达均增强。可见在吗啡使用的各个阶段心钠素都在发挥它的作用,对抗吗啡引起的机体各种不利变化。

4 参考文献
1 Kringsholm B, Christoffersen P .Morphological findings in fatal drug addiction: an investigation of injection marks, 
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dependence on morphine at hypothalamus－pituitary－adrenocortical axis. Neuropeptides, 1996, 30:1, 29－36 
3 Taylor CC, Soong YI,Wu D, et al .Morphine stimulates adrenocorticotropin and cortisol release in the late－term ovine 
fetus. Pediatr Res, 1997, 41(3): 411－415
4 Crum RL, Brown MR .Effects of morphine and opioid peptides on plasma levels of atrial natriuretic peptide. Life Sci, 
1988, 43(10): 851－858 
5萨姆布鲁克J, 弗里奇E F, 曼尼阿蒂斯 T, 著. 金冬雁, 黎孟枫, 译 .分子克隆实验指导. 第2版.北京: 科学出版社,
1992. 362－388
6 Witter G, Hope P, Pyle D. Tissue distribution of opioid receptor gene expression in the rat. Biochem Biophys Res 
Commun, 1996, 218: 877－881
7刘 萍, 宋长杰, 席正雄. 吗啡依赖大鼠和小鼠戒断后应激行为和激素水平的观察. 中国药物依赖性通报, 1997, 6: 18－21

THE EFFECTS OF ACUTE ADMINISTRATION OF MORPHINE， MORPHINE DEPENDENCE AND WITHDRAWAL ON RAT CARDIAC ANF GENE EXPRESSION

LIU Yinghui， YAN Xiaokai， HONG Min，YOU Xuedan 
(Biochemistry Department of Jilin University ， Changchun,130021)

ABSTRACT Objective: To study the effects of acute administration of morphine, morphine dependence and withdrawal on rat cardiac atrial natriuetic factor （ANF ）mRNA gene expression. Methods: Contents of rat atria ANF－mRNA were determined by dot blot and Northern blot hybridization.Results: Compared with control group, atria ANF－mRNA contents of all experiment rats increased.Conclusion: Both acute administration of morphine, morphine dependence and withdrawal enhance rat cardiac ANF gene expression. 
KEY WORDS morphine； ANF； gene expression

收稿日期：2001－01－07;修回日期：2001－07－15 

中国药物依赖性杂志

2002年 第11卷 第1期