摘要 目的： 探讨吗啡依赖对小鼠海马不同亚区一氧化氮合酶(NOS)活性的影响。方法： 以剂量递增法皮下注射吗啡建立吗啡依赖小鼠模型，采用还原型辅酶Ⅱ－黄递酶(NADPH－d)组织化学法显示吗啡依赖组、纳洛酮催促戒断组和正常对照组小鼠海马CA1区、CA3区和齿状回NOS阳性神经元。结果： 与对照组相比，吗啡依赖组和纳洛酮催促戒断组海马CA1区和齿状回NOS阳性神经元的数目均明显减少（P<0.01），纳洛酮催促戒断组更为明显，而在CA3区无明显改变。结论： 吗啡依赖和纳洛酮催促戒断小鼠海马CA1区和齿状回NOS活性降低，提示NO合成的能力下降，戒断期下降更明显。这些变化可能是吗啡依赖造成学习记忆功能下降的原因之一。
    关键词 吗啡依赖; 一氧化氮合酶; 海马神经元; 小鼠

    一氧化氮(NO)是一种广泛存在于细胞内及细胞间的气体形式的信息传递分子,具有多种生物学作用。NO在神经系统内主要参与离子通道的调节、神经突触传递及神经元的毒性作用[1,2]。NO参与神经突触传递长时程增强效应(LTP)被认为是学习记忆形成的机制之一。NO在体内由一氧化氮合酶(NOS)催化专一性的左旋精氨酸(L－Arg)生成，NOS活性高,合成NO的能力增强,反之合成NO的能力降低。那么NO是否与吗啡依赖造成学习记忆功能下降有关？ 由于NOS是一组同功酶, 均需还原型辅酶Ⅱ(NADPH)作为辅酶。Hope等[3] 和Dowson等[4] 用免疫组化和组化反应证明NOS和 NADPH－d是同一物质。因此,本研究采用NADPH－d组化法对吗啡依赖小鼠海马不同亚区NOS阳性神经元的变化进行了研究,以期了解吗啡依赖对学习记忆功能的损害与海马不同亚区NOS活性变化的关系。

1 材料与方法
1.1 动物与药品
选用♂昆明小鼠26只,体重19－22 g,由天津医学实验动物中心提供。盐酸吗啡注射液由青海制药厂生产,批号830305。盐酸纳洛酮由北京四环制药厂生产,批号990514。
1.2 实验方法
1.2.1 动物分组及依赖模型的建立 将26只昆明小鼠随机分成两组,对照组9只,实验组17只。实验组采用剂量递增法皮下注射(sc)吗啡形成吗啡依赖模型, 具体方法如下： 每日给药3次(6:00,12:00, 18:00),共7 d,每日剂量分别为5,10,20,40,80,160,160 mg·kg－1,d7只在晨6:00给药1次，末次给药后3 h随机将实验组小鼠再分为吗啡依赖组(简称依赖组)和纳洛酮催促戒断组(简称戒断组)。戒断组腹腔注射(ip)盐酸纳洛酮4.5 mg·kg－1,依赖组ip等量的生理盐水。对照组小鼠处理步骤同实验组,仅注射等量的生理盐水。
1.2.2 观察指标 观察盒(28 cm×23 cm×40 cm)底部放少许木屑,小鼠ip盐酸纳洛酮或生理盐水后立即放入观测盒内,记录15 min内跳跃、“湿狗”样抖动、打洞(逃避反应) 的次数,以及15 min内各组出现上睑下垂、腹泻、前爪震颤的动物数,ip纳洛酮或生理盐水前后30 min各记录一次体重,体重的差值作为体重下降的指标。
1.2.3 组织取材 小鼠经戊巴比妥钠(40 mg·kg－1) 腹腔麻醉后,从左心室快速灌注生理盐水 100－150 ml,再用500 ml 4％多聚甲醛磷酸缓冲液灌注固定。迅速取脑后入上述固定液后固定7－9 h,投入20％蔗糖液中浸泡12 h以上。冰冻切片机冠状位切片,片厚50 μm,收集于pH=7.4的0.01 mmol·L－1磷酸缓冲液(PBS)中备用。
1.2.4 NADPH－d显色 切片在NADPH－d 孵育液(37℃)中孵育1 h。孵育液是由NADPH(Sigma公司 )5 mg,氯化硝基四氮唑蓝(NBT,华美医药公司)2.5 mg,0.3％ 曲拉通－三羟甲基氨基甲烷巴比妥缓冲液(Triton－TBS) 5 ml组成。然后用0.01 mmol·L－1 PBS终止反应并充分漂洗、裱片、干燥,两月后脱水、透明、封片。
1.2.5 NOS阳性神经元计数 每组选取对应断面的海马脑片8张,分别统计CA1、CA3区和齿状回内NOS 阳性神经元数目。
1.2.6 数据处理 所有数据均经《中国医学百科全书· 医学统计学软件》分析,计量资料采用方差分析,结果用x ±s表示； 计数资料采用χ2检验。

2 结果
2.1 吗啡依赖小鼠模型的建立及纳洛酮催促戒断
    吗啡依赖期间,实验组小鼠体重明显降低,而对照组小鼠体重明显增加。吗啡依赖后,ip纳洛酮或生理盐水,发现戒断组戒断症状明显,15 min 内平均跳跃次数、“湿狗”样抖动次数及出现上睑下垂、腹泻、前爪震颤的动物数和给药前后30 min体重降低的数值明显多于对照组和依赖组。依赖组仅有打洞、跳跃等少许症状，与对照组比较无显著性差异。而对照组基本上没什么表现(见表1)。 证明本实验建立的模型是成功的。
2.2 海马不同亚区NOS阳性神经元的分布
    本实验NOS阳性反应呈蓝色,阳性产物集中于胞浆和突起部分,胞核不着色。
2.2.1 对照组海马不同亚区NOS阳性神经元的形态和分布 对照组小鼠海马的CA1区、CA3区和齿状回都有NOS阳性神经元分布。NOS阳性神经元散在分布于CA1和CA3区锥体层、腔隙分子层和辐射层以及齿状回的分子层、颗粒层和多形层(图1,图2,图3)。其中,在CA1区和齿状回中NOS 阳性神经元较多尤其是CA1区,而CA3区阳性神经元较少。CA1和CA3区NOS阳性神经元以锥体细胞为主,齿状回NOS阳性神经元呈锥体形和圆形。在各区中,CA3区NOS阳性神经元染色最浅。
2.2.2 依赖组海马不同亚区NOS阳性神经元的形态和分布 依赖组海马结构内NOS阳性神经元亦见于CA1、CA3区和齿状回。各区细胞形态和分布模式与对照组相比未见明显差别。但CA1区和齿状回NOS阳性神经元数目明显减少(P<0.01),染色变浅(图4,图5,表2)。CA3区阳性神经元数目和染色强度未见有明显改变(P>0.05)(图6,表2)。
2.2.3 戒断组海马不同亚区NOS阳性神经元的形态和分布 戒断组海马结构内NOS阳性神经元亦见于CA1 、CA3区和齿状回,各区的细胞形态和分布模式与对照组和依赖组比差异无显著性。但在CA1区和齿状回NOS阳性神经元数目与对照组比极度减少(P<0.01), 染色的强度也极度变淡。与依赖组相比也明显减少(P<0.01),(图7, 图8, 表2),而在CA3区NOS 阳性神经元数目和染色强度与对照组和依赖组相比均未见有明显改变(图9,表2)。

3 讨论
    NO是一种具有多种生物活性的信息分子，广泛存在于哺乳动物体内的许多组织,如神经细胞、血管内皮细胞、嗜中性白细胞等。NO由L－Arg和氧经NOS催化生成。NOS有3种亚型：神经元型(nNOS)、诱导型(iNOS) 和内皮型(eNOS),其中以nNOS在脑的表达最多。NO 产生后以自由扩散的方式通过细胞膜激活邻近突触前后部位鸟苷酸环化酶,并与血红蛋白上的铁结合使之活化,催化三磷酸鸟苷(GTP)转化为环磷鸟苷(cGMP),激活依赖cGMP的蛋白激酶,通过膜上的磷酸化反应调节离子通道、血管舒张、抑制平滑肌细胞增殖、抑制血小板粘附、聚集和参与神经突触传递。NO还可激活多聚－ADP核糖转移酶，通过ADP核糖基化而表现NO的毒性作用。 本实验采用NADPH－d组织化学法来间接显示NOS在海马的分布,以此确定NOS活性及NO 的合成能力。结果表明,吗啡依赖小鼠海马CA1区和齿状回NOS阳性神经元数目明显减少,尤以戒断组减少程度最为明显,而在CA3区NOS阳性神经元数目没有明显改变。提示吗啡依赖使海马CA1区和齿状回NOS活性降低及NO的合成能力下降尤以戒断期最为明显,而对CA3区NOS活性和NO的合成能力没有明显影响。
    吗啡依赖造成海马CA1区和齿状回NOS活性降低可能通过如下途径：(1) 慢性吗啡处理改变了细胞内 Ca2＋的动态平衡,使脑内Ca2＋通道数目增加,而且突触体对Ca2＋的摄入增加[5] ,造成细胞内Ca2＋过高即超载。细胞内Ca2＋超载可造成细胞一系列病理性损伤,如Ca2＋/Mg2＋－ATP酶活性降低、Na＋－Ca2＋交换及Ca2＋－H＋交换障碍等，细胞的结构和功能受损。细胞内Ca2＋超载也可激活钙依赖性酶(如核酸内切酶)，进而使DNA断裂降解，并使胞浆内蛋白质发生交联，甚至细胞骨架破裂，从而使染色体凝集,细胞皱缩而发生凋亡。细胞内Ca2＋超载还可引起钙调素(CaM)从游离状态转向结合状态或激活钙依赖性蛋白水解酶,导致CaM含量下降,使其对细胞内Ca2＋的调节作用减弱，以致细胞内Ca2＋继发性升高,进一步加剧细胞的损伤作用和促进凋亡的发生。这些皆间接影响NOS的激活；(2)慢性吗啡处理使脑内产生大量的自由基及超氧化物歧化酶活性下降。自由基增多可使核酸突变、交联、断裂等结构和功能的变化,这些也间接影响NOS活性；(3)慢性吗啡处理激活谷氨酸系统,特别是戒断期谷氨酸系统活动明显增强。过多的谷氨酸导致产生过量的NO,从而发挥NO的神经毒性作用,导致神经元的功能和形态受损,影响细胞NOS活性；(4)慢性吗啡处理会损害机体的内分泌系统尤其是戒断期,内分泌系统损害又可进一步影响神经系统。如慢性吗啡处理会使糖皮质激素分泌增加，而高的糖皮质激素可使海马功能受损[6]。
    总之,本研究通过组织化学方法揭示了吗啡依赖造成海马CA1 区和齿状回神经元NOS活性下降,该下降导致CA1区和齿状回神经元NO的合成能力降低,从而影响学习记忆过程，但确切的生理机制尚有待于进一步阐明。

4 参考文献
1 Moncada S, Palmer RMJ, Higgs EA.Nitric oxide: physiology,pathology and pharmacology. Pharmacol Rev, 1991, 43:
109－142
2 Zhang J, Dawson VL,Dawson TM, et al. Nitric oxide activation of poly(ADP－ribose) synthetase in neurotoxicity. 
Science, 1994, 263: 687－689
3 Hope BT, Michalel GJ, Knigge KM.Neuronal NADPH－diaphorase is a nitric oxide synthase.Pro Natl Acad Sci USA,
1991, 88: 2811－2814
4 Dawson VL,Dawson TM,Bartly DA,et al.Mechanisms of nitric oxide mediated neurotoxicity in primary brain cultures. 
J Neurosci, 1993, 13: 2651－2656(下转第43页)
(上接第21页)

5 Hauser KF,Stience－Martin A,Mattson MP,et al.μ－ opioid receptor －induced Ca2＋ mobilization and astroglial de_ 
velopment: morphine inhibits DNA synthesis and stimulates cellar hypertrophy through a Ca2＋－dependent mechanism. 
Brain Res, 1996, 720: 191－203
6 Budziszewska B,Jaworska L,Lason W.Repeated morphine administration down－regulates glucocorticoid,but not min_
eralocorticoid, receptors in the rat hippocampus. Psychoneuroendocrinology, 1995, 20(1): 75－81

IMPACT OF MORPHINE DEPENDENCE ON NOS 
POSITIVE NEURONS IN MICE HIPPOCAMPUS 

WEI Jie1, LI Jisheng2, ZHANG Yinguo3, LI Hongwan1, YANG Chunrong1 
1(Department of Psychiatry of Ankang Hospital, Tianjin Public Security Bureau ,Tianjin, 300240)
2(Department of Anatomy of Medical College of Chinese People's Armed Police Forces, Tianjin, 300162)
3(Department of Physiology of Medical College of Chinese People's Armed Police Forces, Tianjin, 300162)

ABSTRACT Objective: To study the impact of morphine dependence on the activity of NOS in subareas of mice hippocampus.Methods: Mice were given (sc) gradually increasing doses of morphine to form morphine dependent model. NADPH－diaphorase with a histochemical method was used to study the distribution areas of NOS positive neurons in CA1, dentate gyrus and CA3 of hippocampus of morphine dependent group, naloxone－precipitated withdrawal group in morphine dependent mice and control group. Results: Compared with control group , the number of positive cells decreased obviously in CA1 and dentate gyrus of both groups in morphine dependent mice, especially the later. Conclusion: The activity of NOS in CA1 and dentate gyrus of morphine dependent and naloxone－precipitated withdrawal groups has decreased, especially the later, which suggests that the synthesis of NO has decreased. Those changes may be some of the reasons causing learning and memory deficits.
KEY WORDS morphine dependence; NOS; hippocampal neuron; mouse

收稿日期:2000－12－15;修回日期:2001－03－21

中国药物依赖性杂志

2002年 第11卷 第1期