摘要 目的: 探讨褪黑素对吗啡依赖小鼠肝组织损害的治疗作用。方法: 用皮下定量注射吗啡的方法建立吗啡依赖小鼠模型，经褪黑素治疗4周后，用HE染色、酶组织化学染色及图像分析方法，在光镜下观察吗啡依赖小鼠肝脏组织结构及酶组织化学变化。结果: 肝细胞变性的发生率在吗啡自然戒断组为10例（10/10）；ACP、LDH活性升高，而SDH活性降低。褪黑素治疗组仅1例（1/10），且为个别肝细胞水肿；ACP、LDH和SDH活性正常。结论: 褪黑素可使吗啡所致的肝损害得到良好恢复。
    关键词 褪黑素； 吗啡成瘾； 病理学； 酶组织化学； 小鼠

    关于吗啡中毒所致睾丸、附睾、前列腺等组织病理学改变的研究已有报道[1]，但对肝脏影响的研究报道尚不多见。有研究认为松果体分泌的褪黑素(melatonin, MT)具有抗机体衰老的作用[2]， 但尚未见到对吗啡依赖小鼠肝组织结构影响方面的报道。本文通过建立动物模型，采用形态学研究方法观察MT对肝损害的保护治疗作用，为临床应用提供实验依据。

1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 动物 昆明小鼠60只，♂，体重18－22 g。由北京大学医学部实验动物部提供。
1.1.2 试剂 盐酸吗啡：青海制药厂产品，批号：9407020 ；褪黑素：北京生鸿技术有限责任公司产品。
1.2 实验方法
1.2.1 动物模型的建立 实验动物分为两批，每批30只，每批小鼠又分为正常对照组、自然戒断组和MT治疗组。第一批小鼠自然戒断组背部皮下注射（sc）吗啡70 mg·kg－1，每日2 次, 连续2周后自然戒断至实验结束,共4周。MT治疗组，背部sc吗啡70 mg· kg－1，每日2 次，连续2周后用MT治疗，25 mg·kg－1，灌胃(ig)给药，每日1次，至实验结束。正常对照组背部sc同剂量的生理盐水。第二批小鼠自然戒断组背部sc吗啡70 mg·kg－1，每日2 次, 连续4周后自然戒断至实验结束,共8周。MT治疗组，背部sc吗啡70 mg·kg－1，每日2 次，连续4周后用MT治疗，50 mg·kg－1，ig 给药，每日1次，至实验结束。正常对照组背部sc同剂量的生理盐水。
1.2.2 标本采集及处理 上述两批动物分别在4周和8周后用颈椎脱臼法快速处死，取肝右叶，分成两等份，一份入Bouin液固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，OLYMPUS显微镜观察，摄像。另一份置OCT包埋剂（CRYO－form，USA，MA）中，经液氮冷冻包埋，用Leica冰冻切片机切成6 μm厚切片，吹干，冷冻备用。
1.2.3 酶组织化学染色 分别按Cheyen、Lojda、偶氮偶联法、Cullings等方法[3]对琥珀酸脱氢酶(SDH)、乳酸脱氢酶(LDH)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(ALP)进行酶组织化学反应，光镜下酶组织化学定性、定位观察(双盲法)。
1.2.4 定量分析及统计学处理 根据酶组织化学反应颜色的深浅，将肝组织中各种酶的活性分别以3个等级表示，即强阳性(＋＋＋), 中等阳性(＋＋)和阳性(＋)。其中SDH、ACP用Leica Q500MC 图像分析系统进行定量分析，每组随机取5只动物切片，每张切片随机选择15个视野，测试各成分的相对含量(灰度值)，根据公式OD=Lg(空白灰度/标本灰度)计算出平均光密度（MOD）值和S值，结果用平均光密度表示，组间比较采用t检验。

2 结果
2.1 HE染色光镜观察
2.1.1 吗啡依赖小鼠自然戒断组 第一批10只小鼠肝脏均可见少量肝细胞变性，间质淤血水肿，肝组织结构不清晰。第二批10只小鼠的肝脏均可见许多肝小叶内有大小不等的肝细胞变性区和局灶性坏死区，有的肝细胞呈水肿和空泡样变性，胞质染色很浅；有的肝细胞溶解成碎屑。这些变性区和局灶性坏死区肝细胞与正常肝细胞相间排列，肝间质淤血水肿（图1）。
2.1.2 吗啡依赖小鼠褪黑素治疗组 
    第一批小鼠肝脏仍可见少量肝细胞变性，间质淤血水肿未完全消失，肝组织结构基本清晰，但未完全恢复正常。
    第二批小鼠可见肝组织结构清晰，间质淤血水肿完全消失，肝小叶结构基本恢复正常，仅有1例小鼠肝脏见到极少数肝细胞变性（图2）。
2.2 酶组织化学染色定性和图像分析定量测定
2.2.1肝脏酶组织化学活性的变化 第二批小鼠与正常对照组相比，吗啡自然戒断组ACP和LDH活性明显升高，SDH、ALP活性降低。MT治疗组上述各酶的活性与正常对照组无明显差异，结果见表1，（图3－7）。
2.2.2 肝脏ACP及SDH活性定量 从第二批小鼠肝脏ACP及SDH活性图像分析定量测定结果可以看出：吗啡自然戒断组ACP高于正常对照组(P<0.05), 而SDH活性低于正常对照组(P<0.05), MT治疗组ACP和SDH活性与正常对照组比较无显著性差异（P>0.05）,而与自然戒断组比较有显
著性差异(P<0.05),结果见表2。

3 讨论
    基础及临床均证实[4]海洛因和吗啡依赖可引起下丘脑－垂体－性腺轴、甲状腺轴、肾上腺皮质轴等一系列内分泌系统和其他系统功能紊乱，造成多种脏器组织损伤。对阿片类药物依赖戒断所致组织器官损伤的治疗也引起医学界的关注。
    MT是一种主要由松果体细胞分泌的肽类激素，参与调节时间生物学节律，生殖系统发育，月经周期节律，以及中枢神经系统的活动等。有研究报道[5], MT的结合位点不仅存在于西伯利亚仓鼠的大脑内， 而且在其外周器官如小肠、 肾脏、肝脏和肺等有大量的结合位点。另有研究报道[6，7]，MT具有抗氧化活性，能有效地清除羟自由基和烷过氧自由基，能防治生物膜的脂质过氧化损伤。
    本研究病理组织学检查结果为：第一批小鼠MT治疗组与自然戒断组相比，肝细胞变性恢复不明显；第二批小鼠MT治疗组与自然戒断组相比，自然戒断组10/10变性，且包括细胞水肿和脂肪变性，治疗组1/10变性，且仅为脂肪变性，肝细胞变性得到良好恢复，其原因可能与MT的剂量增加和治疗时间延长有关。
    肝细胞内酶活性的定性、定量分析，是一种反应肝细胞受损程度和代谢状况的方法，比临床上常用的血清酶检测更直接准确[8]。
    SDH为有氧代谢－三羧酸循环的限速酶和线粒体的标志酶，SDH活性可反映肝细胞三羧酸循环的强弱。ALP是一组水解磷酸键的酶，它同细胞增殖、分化，特别是同细胞膜上物质的转运有关。当吗啡进入机体后，通过门脉通路到达肝脏，使间质毛细血管扩张淤血，局部片灶性出血，部分肝细胞颗粒样变性，从而导致了细胞内SDH (P<0.05)、ALP 活性的降低。MT治疗组SDH活性与正常对照组相比，无显著性差异(P>0.05)而与自然戒断组相比有显著性差异(P<0.05)，说明MT对吗啡依赖小鼠肝细胞SDH活性恢复有促进作用。
LDH是细胞糖无氧代谢的重要酶，本实验中其活性的增加，可能是由于SDH活性降低以后，LDH在三羧酸循环发生障碍时所起到的一种能量代谢补偿作用。
A    CP是溶酶体的标志酶，通常存在于细胞的溶酶体和吞噬体内。ACP活性的变化在一定程度上反映了细胞吞噬过程中细胞消化功能的强弱，同时也反映了溶酶体膜的受损程度及通透性的变化[9]。本实验观察到吗啡自然戒断组小鼠肝细胞内有大小不等的，呈泥沙样颗粒的ACP强阳性产物，其活性明显高于正常对照组 (P<0.05)，提示吗啡进入小鼠体内后，可能直接地损伤了肝细胞，从而影响了溶酶体膜的通透性，ACP扩散，导致所谓的强阳性反应。而MT治疗组ACP活性与正常对照组相比，无显著性差异，而与自然戒断组相比有显著性差异(P<0.05)，说明MT对吗啡依赖小鼠肝细胞ACP活性恢复也有促进作用。
    本研究结果显示，用MT治疗吗啡中毒造成的肝组织结构功能损害，可以得到良好的恢复。其机理可能是MT与肝细胞膜上位点结合，清除自由基防止生物膜的脂质过氧化，从而对溶酶体膜和细胞膜起到保护作用。
致谢：本文照片由北京大学医学部组胚系毕振伍技师摄制，特此感谢。

4 参考文献
1 王 芳, 郭晓红, 杨 耘, 等. 海洛因与吗啡依赖恒河猴的病理组织学研究. 中国药物依赖性杂志, 1999， 8： 98－102.
2 Pierpaoli W, Regelson W. Pineal control of aging: effect of melatonin and pineal grafting on aging mice. Proc Natl Acad 
Sci USA, 1994， 91: 787－791.
3 李肇特, 主编.组织化学讲义（第3版）（内部刊物）. 1993. 11.
4 Kosten TA. Clonidine attenuates conditioned aversion produced by naloxone－precipitated opiate withdrawal. Eur J 
Pharmacol, 1994, 254(1－2): 59－63.
5 Paul P, Lahaye C, Delagrange P, et al. Characterization of 2－[125I]iodomelatonin binding sites in Syrian hamster 
peripheral organs.J Pharmacol Exp Ther, 1999, 290(1): 334－340.
6 Pier C,Marra M,Moroni F,et al. Melatonin: a peroxyl radical scavenger more effective than vitamin E . Life Sci,1994,
55: 271－276.
7 李明阳， 田 侠， 侯京武， 等. 褪黑素拮抗鼠肝线粒体自由基产生的实验研究. 中国药理学通报， 1998， 14： 260－262．
8 梁扩寰, 主编.肝脏病学.北京： 人民卫生出版社, 1995.
9 华 文, 唐军民, 唐 岩, 等. RCS大鼠和Wistar大鼠视网膜酸性磷酸酶活性的动态观察.中国组织化学与细胞化学杂志,
1999, 8： 161－163.

EFFECT OF MELATONIN ON PATHOLOGICAL AND ENZYME 
HISTOCHEMISTRY CHANGES IN LIVER OF MORPHINE DEPENDENT MICE

LI Yinsheng1, TIAN Sumin3,TANG Yan2,LI Feng2,
TANG Junmin2,QIU Xuecai4

1(Department of Histology and Embryology, Xinxiang Medical College, Xinxiang, 453003)
2(Department of Histology and Embryology, Peking University Health Science Center, Beijing ,100083)
3(Department of Physiology, Xinxiang Medical College, Xinxiang, 453003)
4(Department of Physiology,Peking University Health Science Center, Beijing,100083)

ABSTRACT Objective: To study the recovery degree of liver of morphine dependent mice after being treated with melatonin.Method: A physical dependent model in mice was established by subcutaneous injection of morphine, and the pathological and enzyme histochemistry changes were reviewed by light microscope in liver tissue.Result: At the end of the forth week of natural withdrawal, hydropic and degeneration were found in liver cells of all morphine dependent mice(10/10), the activities of ACP, LDH were increased, while the activities of SDH, ALP were reduced; the pathological changes of melatonin treatment group were greater than those of natural withdrawal group, one or two fatty degeneration cells were seen in liver of only one mouse(1/10) and the activities of ACP, LDH, SDH recovered to normal. Conclusion: The structure and function in liver could get more rapid recovery after being treated with melatonin.
KEY WORDS melatonin; morphine dependent; mice; pathology; enzyme histochemistry
收稿日期:2000－07－16; 修回日期:2001－06－09

中国药物依赖性杂志

2001年 第10卷 第4期