摘要 目的:结合戒断体征的观察从分子水平研究吗啡依赖和戒断机理及丁丙诺啡对吗啡戒断的影响。方法:观察吗啡戒断及经丁丙诺啡治疗大鼠的戒断体征；利用核酸分子杂交技术研究其垂体阿黑皮源(POMC)基因表达的变化。结果:丁丙诺啡能有效减轻或消除戒断体征,吗啡依赖及戒断时大鼠垂体POMC－mRNA含量下降,丁丙诺啡对其影响不大。结论: 吗啡依赖和戒断抑制大鼠垂体POMC基因表达,丁丙诺啡能纠正吗啡躯体依赖,但从基因水平看丁丙诺啡可能也具有依赖潜能。

    关键词 吗啡依赖; 吗啡戒断; 阿黑皮源; 基因表达; 丁丙诺啡

    近年来,药物滥用在世界范围内已成为一种严重的社会问题,其中危害最大的是阿片类药物的滥用。阿片类药物是通过与体内专一的阿片受体结合而起作用的,自从70年代阿片受体的内源性配体被分离得到以来,内源性阿片肽和药物耐受的关系就成为探索阿片类药物依赖机制的重要研究方向，其中β－内啡肽与外源性阿片成瘾关系最大。β－内啡肽源于POMC,POMC由腺垂体分泌表达[1] ,吗啡是阿片类的代表药物，本实验利用核酸分子杂交手段检测吗啡依赖及戒断时大鼠垂体POMC基因表达,在基因水平上研究外源性阿片类药物对内源性阿片肽的影响,并连续观察了纳洛酮引起的戒断体征;同时也研究了丁丙诺啡对上述指标的影响，以期从分子水平为临床的研究、治疗提供理论依据。

1 材料和方法

    1.1实验动物 

    正常♀Wistar大鼠,体重160－220 g 平均191.3 g±s 14.6 g ,吉林大学动物部提供。

    1.2 主要实验药物及试剂

    盐酸吗啡（沈阳第一制药厂生产，批号961002）,盐酸纳洛酮（北京四环制药厂生产,批号9610111）， 盐酸丁丙诺啡(青海制药厂生产, 批号960607）。载有大鼠POMC－cDNA的质粒pNI－9由洪敏教授在加拿大Laval大学克隆,α－32P－dCTP北京亚辉公司提供,随机引物标记探针套件,美国Promega公司提供。

    1.3 实验方法

    1.3.1戒断体征的观察及评定  吗啡戒断组及丁丙诺啡治疗组大鼠末次注射吗啡d2－8（d7除外）纳洛酮催瘾后1 min开始观察,共10 min。评分标准为10 min内齿颤和咀嚼阵数、直立、寒战、跳跃次数，直接记录得分，每2 min评定1次上睑下垂、眨眼、竖毛体征，无症状为0分，严重为2分，连续评定5次，计算总分进行综合评价。

    1.3.2动物分组及处理 大鼠随机分组,每组7只。对照组:每日 ip 2次(8:00，20:00) 生理盐水(体积与当日注射吗啡相同),连续7 d。d8起改为每日ip 1次生理盐水（时间及体积与当日注射丁丙诺啡相同）。吗啡依赖组：每日ip 2次(8:00及20:00)盐酸吗啡,日剂量为d1、d2 20 mg·kg－1, d3 40 mg·kg－1,d4 60 mg·kg－1,d5 80 mg·kg－1,d6 90 mg·kg－1,d7 100 mg·kg－1 ;d8早6:00处死。吗啡戒断组：前7 d处理与吗啡依赖组相同，d8－14（d13未观察）每日1次(7:30)ip 4 mg·kg－1纳洛酮催瘾，每次纳洛酮催瘾后观察戒断体征，d14处死；丁丙诺啡治疗组：前7 d处理及观察同吗啡依赖组，d8 起改为每日ip 1次（20：00）盐酸丁丙诺啡0.2 mg·kg－1，并于 d8－14（d13未观察）早7:30 用 4 mg·kg－1 纳洛酮催瘾，观察戒断体征，d14处死。

    1.3.3核酸分子杂交 各组大鼠处死后分别留取垂体，提取组织总RNA,分别进行斑点及Northern印迹,用[α－ 32P]标记的大鼠POMC－cDNA探针与垂体印迹进行斑点及Northern杂交。

    1.3.4 统计学方法 所有数据均以x ±s表示，用t检验进行组间显著性分析。

2 结果

    2.1丁丙诺啡对大鼠戒断体征的影响

    丁丙诺啡治疗前,未治疗组与丁丙诺啡治疗组戒断体征得分差异无显著性,两组基线水平相近。给药后d1－3,治疗组戒断体征得分低于未治疗组。给药后d4 、d6 ,治疗组、未治疗组得分之间差异无显著性,见表1。

    2.2吗啡依赖,戒断及丁丙诺啡对大鼠垂体POMC基因表达的影响 

    从图1、2 可见,吗啡依赖时垂体POMC－mRNA含量明显降低,戒断后虽有所回升,但仍低于对照组，(P<0.05),丁丙诺啡治疗组d6， 给药略低于对照组(P<0.05)。

3 讨论 

    POMC是ACTH 、β－内啡肽及促黑素的共同前体，在脑内的主要表达部位是垂体，因此垂体POMC基因表达的情况可以在基因水平上反映脑内β－内啡肽的变化。本实验发现:吗啡依赖时大鼠垂体POMC－mRNA水平下降,说明外源性阿片药物抑制了垂体β－内啡肽的基因表达。戒断d5、d7时大鼠的戒断体征已基本消失，而戒断d7时POMC－ mRNA水平仍显著低于对照组大鼠,显示了二者的不同步性。联系阿片类药物的心理依赖持续时间长于躯体依赖,此结果提示,外源性阿片类药物的使用使内源性阿片肽系统受到抑制,可能也是造成阿片类药物心理依赖的重要生物基础之一。目前关于阿片类药物引起精神依赖的生物学基础的研究主要集中在对中脑边缘系统的多巴胺神经元的研究，Robinson 和Berridge认为[4] :长期使用成瘾药物导致的中脑多巴胺神经元的进行性增加的神经适应性改变使动物对用药特定环境的过分敏感,最终引起中脑多巴胺神经结构独立于其他包括介导戒断反应的神经结构，因此会产生不与戒断体征共进退的渴求用药行为。此理论较好地解释了精神依赖持续存在的机理,但抑制多巴胺系统的药物在戒毒后复吸方面并未达到预期的效果,这表明,精神依赖可能是一个多因素参与的复杂过程。因此，内源性阿片肽系统与精神依赖的关系及其与多巴胺系统可能存在的相互联系也应作为进一步研究精神依赖的着眼点之一。从以上分析也可以看出,要解释精神依赖形成和存在的原因不能单纯从某一个系统出发,而应从多因素考虑。

     丁丙诺啡对阿片受体具有激动和拮抗双重作用。目前临床上正试用于阿片依赖替代治疗。有文献报道，丁丙诺啡能够很好地纠正可卡因所致的位置偏爱效应[5]，并能有效抑制可卡因所致的猴的自身给药现象[6]。而且临床上研究发现，丁丙诺啡能减轻吗啡成瘾者的戒断症状。本实验发现，用丁丙诺啡治疗d1－3 ,治疗组戒断体征得分低于未治疗组。从本实验结果看，作为治疗吗啡依赖的替代药物,丁丙诺啡能很好地抑制吗啡戒断体征，从纠正吗啡的躯体依赖角度说，是较为理想的吗啡依赖治疗药物。而从本实验的分子杂交结果看,丁丙诺啡治疗d6 的大鼠, POMC基因表达水平仍显著低于对照组。因此，丁丙诺啡在短期内不能从基因水平纠正外源阿片类药物引起的内源性阿片肽系统的抑制。另外，丁丙诺啡虽然对阿片受体具有激动和抑制双重作用,但一般情况下多表现对阿片受体的激动作用，所以不能排除丁丙诺啡本身存在抑制内源性阿片肽系统的可能性。同时，如果上述讨论的精神依赖与内源性阿片肽抑制确有关联，给予丁丙诺啡后, POMC神经元的生物合成活性依然受到抑制亦提示了丁丙诺啡的心理依赖性潜能。

4 参考文献

    1 Blume AJ, Shorr J, Finberg JP, et al. Binding of the endogenous nonpeptide morphine－like compound to opiate re_ceptors. Proc Natl Acad Sci (USA), 1977 , 74(11)： 4927－4931.

    2 Koob GF, Maldonado R,Stinus L.Neural substrates of opiate withdrawal. Trends Neurosci， 1992, 15: 186－191.

    3卢圣栋, 胡晓年, 刘德培, 等，编.现代分子生物学实验技术.北京: 高等教育出版社, 1993: 198－238.

    4 Robinson TE, Berridge KC.The neural basis of drug craving: an incentive－senitization theory of addiction.Brain Res Brain Res Rev, 1993, 18: 192－247. 

    5 Calcagnetti DJ, Keck BJ, Quatrella LA,et al. Blockade of cocaine－induced conditioned place preference: relevance to cocaine abuse therapeutics. Life Sci, 1995, 56(7): 475－483. 

    6 Mello NK,Mendelson JH, Lukas SE, et al. Buprenorphine treatment of opiate and cocaine abuse: clinical and preclinical studies. Harv Rev Psychiatry，1993, 1(3): 168－183. 

    7 Kosten TA, Marby DW, Nestler EJ. Cocaine conditioned place preference is attenuated by chronic buprenorphine treat_ment. Life Sci, 1991, 49(24): PL 201－206.