摘要 目的: 观察大鼠吗啡依赖和戒断状态下脑内前阿黑皮素原（POMC ）mRNA的变化。 方法: 采用腹腔注射法，按剂量递增原则建立大鼠吗啡依赖动物模型，同时建立生理盐水对照组。吗啡依赖大鼠随机分为依赖组和戒断组。对照组和依赖组动物于末次注射后3 h，戒断组大鼠于末次注射后72 h迅速断头处死取脑，收集各个脑区组织总RNA标本。以POMC反义RNA探针对得到的RNA 标本进行Northern Blot印迹杂交，用电子计算机图像处理系统对所得结果进行分析。结果: 吗啡依赖大鼠下丘脑POMC mRNA的表达仅为生理盐水对照组的69.56％±s 4.7％，戒断72 h状态下的吗啡依赖大鼠下丘脑POMC mRNA的表达恢复至生理盐水对照组的78.26％± s5.3％；海马、纹状体和垂体POMC mRNA表达均为阴性。结论: 吗啡依赖大鼠下丘脑POMC mRNA的表达较生理盐水对照组有显著下降，戒断72 h状态下的吗啡依赖大鼠其下丘脑POMC mRNA的表达较依赖组大鼠有显著回升，但仍显著低于正常组水平。此结果从分子生物学水平证实阿片类药物依赖机制与其引起内源性阿片肽系统功能变化有关。
    关键词 吗啡依赖; 吗啡戒断; 前阿黑皮素原; mRNA; 下丘脑
    
    阿片类药物在临床麻醉和疼痛治疗中占有重要位置，但是此类药物容易产生依赖性。许多研究表明外源性阿片类药物的应用抑制了内源性阿片肽系统的功能，放射免疫法对肽水平的测定结果也支持这一点，据此推测内源性阿片肽的合成过程受到抑制。本实验研究吗啡依赖状态和戒断状态下大鼠的中枢神经系统前阿黑皮素原（POMC）mRNA水平的变化，观察阿片类药物依赖及戒断大鼠脑内内源性阿片肽合成的改变，从分子生物学水平为上述推测成立与否提供客观依据。

1 材料与方法
1.1 动物吗啡依赖模型的建立和分组 
    ♂SD大鼠，购自上海中科院动物繁育场，试验前体重为180－220 g。动物饲养室温度控制在18－22 ℃，光照时间为上午8：00至晚18：00， 动物摄食、 饮水自由。根据纪家涛的方法[1]建立吗啡依赖大鼠动物模型，采用剂量按日递增的原则，给予动物腹腔注射(ip)盐酸吗啡，连续给药至d9，剂量依照表1，末次给药剂量为55 mg·kg－1。对照组动物（n=8）以同样的时间程序给予和吗啡依赖组动物等体积的生理盐水, ip至d9。
1.2 标本处理和POMC mRNA的测定 
    将吗啡依赖大鼠随机分为吗啡依赖组（n=8）和吗啡戒断组（n=8）。生理盐水对照组和吗啡依赖组大鼠于末次注射后3 h，吗啡戒断组大鼠于末次注射后自然戒断72 h将动物迅速断头处死取脑，分离大鼠海马、纹状体、下丘脑和垂体，收集各个部位组织总RNA标本。将抽提所得的组织中总RNA在核酸蛋白分析仪上进行鉴定。标本的检测结果，测得OD260/280值为1.82，表明提取所得到的RNA无明显蛋白质和DNA的污染。将RNA标本在甲醛变性的1.0％琼脂糖凝胶中电泳，可以清晰地观察到18 s和28 s两条带(图1)，表明提取所得的RNA标本未发生明显降解。以POMC反义RNA探针对得到的RNA 标本进行Northern Blot印迹杂交，用电子计算机图像处理系统对所得结果进行分析。

2 结果
    将Northern Blot印迹杂交结果用电子计算机图像处理系统分析，显示除下丘脑以外，海马、纹状体和垂体组织内POMC mRNA均为阴性，与文献报道的POMC mRNA细胞定位相符[2]，下丘脑组织抽提所得的RNA标本杂交后显色（图2），计算机图像处理系统分析后结果（图3）表明吗啡依赖大鼠下丘脑POMC mRNA的表达仅为对照组的69.56％±s 4.70％，戒断72 h状态下的吗啡依赖大鼠其下丘脑POMC mRNA的表达恢复至生理盐水对照组的78.26％±s 5.30％，但仍低于正常组水平。

3 讨论
    早期的研究结果表明，外源性阿片类药物的应用抑制体内内源性阿片肽系统的功能[3，4]。我们曾经报道阿片类药物成瘾的动物和人体内源性阿片肽含量减少，戒断后逐步回升[5]，据此我们推测阿片类药物的成瘾机制与其抑制内源性阿片肽合成有关。然而阿片类药物抑制内源性阿片肽合成的详细机制和具体环节并不明确，为进一步了解外源性阿片类药物对内源性阿片肽的合成的抑制情况，我们研究了其前体POMC的mRNA在吗啡依赖及戒断过程中含量的变化。此研究结果表明，吗啡依赖大鼠下丘脑POMC mRNA含量显著低于正常水平；戒断以后有所回升，但短期内难以恢复至正常水平。外源性阿片类药物的应用抑制了某些脑区内源性阿片肽的前体POMC的信使RNA的转录，这一结果直接说明了外源性阿片类药物的应用是抑制内源性阿片肽体内合成过程的关键环节，在停止使用外源性阿片类药物以后，内源性阿片肽的体内合成有所恢复，但短期内难以恢复至正常水平。
    大鼠在吗啡依赖状态下，其内源性阿片肽系统发生不同的适应性变化，POMC基因表达与亮氨酸脑啡肽（LEK）的释放都减少[4,6]，而强啡肽的水平有所上升。β－内啡肽和亮氨酸脑啡肽的释放导致了μ受体和δ受体的兴奋，此种受体兴奋产生了奖赏效应；而强啡肽的释放引起κ受体兴奋则产生厌恶效应。正是由于出现这种改变，当外源性阿片类药物停止使用后，体内缺乏μ受体及δ受体激动剂来拮抗已升高的强啡肽水平，从而出现了以κ受体兴奋活动为主的情绪状态和厌恶反应，进而产生了戒断状态下的痛苦心境。
    本研究结果表明：吗啡依赖大鼠下丘脑POMC mRNA的表达较正常对照组大鼠有显著下降，戒断后其下丘脑POMC mRNA的表达有明显回升，但是仍显著低于正常水平。此结果从分子生物学水平证实阿片类药物成瘾时某些脑区的内源性阿片肽合成的关键环节受到抑制，戒断后此种抑制可以逐步缓解。

4 参考文献
1 纪家涛， 王新华， 由振东.吗啡依赖大鼠模型的建立.第二军医大学学报， 1997, 18: 81.
2 何 鸣.吗啡依赖与戒断大鼠伏隔核单胺、类阿片肽及下丘脑POMC mRNA改变的研究.中国心理卫生杂志， 1995， 9： 
9－13.
3 Wuster M, Sacchulz K, Herz A. Inquiry into endorphinergic feedback mechanisms during the development of opiate
tolerance/dependence. Brain Res, 1980, 189: 403－411.
4 Bronstein DM, Przewloki R, Akil H. Effect of morphine treatment on pro－opiomelanocortin systems in rat brain. Brain 
Res, 1990, 519: 102－111.
5 王新华， 纪家涛， 由振东， 等， 吗啡成瘾大鼠脑神经核、 垂体和血浆中内啡肽的变化.中华麻醉学杂志， 1997， 17： 282－ 
285.
6 Uhl GR, Ryan JP, Schwartz JP. Morphine alters preproenkephalin gene expression. Brain Res, 1988, 459: 391－397.

CHANGES OF POMC mRNA IN HYPOTHALAMUS OF MORPHINE DEPENDENT 
AND ABSTINENT RATS

CUI Yijie1, WANG Xinhua1, YOU Zhengdong2, SHI Yueyin1, LI Jiale1 
1(Departmant of Anesthesiology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai,200003)
2(Department of Neurobiology, Second Military Medical University, Shanghai, 200003)

ABSTRACT Objective: To observe the contents of POMC mRNA in the central nervous system of morphine dependent and abstinent rats. Method: The animal models of morphine dependence were established by intraperitoneal injecting morphine in rats, three times a day, for 9 days. The dose of morphine was added according to an escalating dose schedule. The rats in control group were injected with saline. The rats with morphine dependence were randomly divided into two groups: morphine dependent group and abstinent group. The rats in dependent group and control group were killed 3 hours after the last injection; the rats in abstinent group were killed 72 hours after the last injection of morphine. Then the pituitary, striatum, hypothalamus and hippocampus were collected and the concentration of POMC mRNA of each region was determined by Northern Blot hybridization. The results were analyzed by a computer assisted photograph analysis system. Result: The level of POMC mRNA of morphine dependent group rats was suppressed to 69.56％ of that of the control group. In morphine abstinent group the level of POMC mRNA increased to 78.26％ of that of the control group compared with the morphine dependent group, but it was still significantly lower than that of the control group.Conclusion:The level of POMC mRNA of morphine dependent group rats was suppressed significantly. In morphine abstinent group the level of POMC mRNA increased compared with that of the morphine dependent group, but it was still lower than that of the control group. These results show that opioids modify endogenous opioid systems in the central nervous system and provide further support for the hypothesis. Such changes may contribute to the mechanisms of opiate dependence and abstinence.
KEY WORDS morphine dependence; abstinence; POMC mRNA; hypothalamus
修回日期：2000－03－22

中国药物依赖性杂志

2000年 第9卷 第4期

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