摘要   目的：观察烟碱对牛脑微血管内皮细胞(BCMEC)表达E－选择素的影响。方法：离体培养新生牛脑微血管内皮细胞;血细胞计数仪测定BCMEC粘附大鼠血单核细胞(MN)的数目；应用ELISA法检测BCMEC表达E－选择素的量。结果：高浓度烟碱(10－5 mol·L－1)单独作用于BCMEC 2 h 后，使BCMEC对MN的粘附率从12.9％±s 0.4％ 增至15.7％±s 0.6％, 且BCMEC也可表达少量的E－选择素; 而当烟碱与BCMEC作用2 h后,再经白细胞介素1β (IL－1β) 诱导4 h，烟碱可浓度依赖性(10－7 mol·L－1－10－5 mol·L－1)地增强IL－1β的诱导作用，增加BCMEC对MN的粘附率以及E－选择素的表达量; 抗E－选择素单克隆(AEmAb)能显著阻断IL－1β诱导BCMEC后对MN的粘附率。结论：烟碱增强IL－1β诱导的脑微血管内皮细胞表达E－选择素的作用。
关键词   烟碱； 血管内皮； 单核细胞； 白细胞介素1β； E－选择素

      烟碱(nicotine,Nic)是烟草中的生物活性碱，大量研究[1－3]表明，烟碱是烟草的主要致依赖成分，而且它对机体也有许多直接毒性作用。流行病学研究[4]显示，吸烟可使脑血管病发病率和病死率均明显上升。最近的研究[5,6]也发现，吸烟烟雾的冷凝聚物可增加培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)与白细胞的粘附,并使HUVEC表达细胞粘附分子的作用增强。由于在脑缺血/再灌注时，白细胞进入炎症部位包括两个阶段并有多种粘附分子的参与，首先是白细胞在血管内皮表面滚动(rolling),此过程由在血管内皮细胞上的细胞粘附分子E－选择素(E－selectin,CD62E)和白细胞表面的L－选择素与它们的寡糖配基(SLex)相互作用来完成，而后通过其它粘附分子迁移到炎症组织[7,8]。本研究将利用体外培养的新生牛脑微血管内皮细胞(bovine cerebral microvessel endothelial cells, BCMEC)，观察烟碱对E－选择素表达的影响，以进一步阐明其对脑血管损伤作用的机制。

1  材料和方法
1.1 药品和试剂
      烟碱重酒石酸盐((－)－nicotine di－[＋]－tartrate salt)，白细胞介素1β(interleukin 1β, IL－1β),意大利Sclavo Research Center 提供；邻苯二胺(OPD)，Sigma公司产品；抗E－选择素单克隆抗体(68－5H11，AEmAb),购自Pharmingen公司；辣根过氧化物酶标记羊抗大鼠IgG(HRP－IgG),Calbiochem公司产品；其他试剂均为分析纯或所能达到的最高等级。
1.2 BCMEC的培养 
      按本室已建立的方法[9]培养。原代细胞12－15 d形成融合单层，用0.1％ 胰酶（Sigma)消化，传代,3－5 d传一代，用4－6代细胞进行实验。
1.3 大鼠血单核细胞(monocytes,MN)的分离 
      按文献[10]进行。将分离提纯的MN和NP用0.1％BSA/PBS溶液悬浮，并调整细胞浓度为5×109·L－1备用。
1.4 细胞粘附实验[11]
      4－6代的BCMEC在96孔培养板生长48 h，呈致密单层，实验前用无血清培养基培养24 h。给药组用不同浓度GSTT预处理2 h，再经IL－1β诱导4 h(AEmAb阻断组同时加入2 μg·ml－1 AEmAb)，加入0.1 ml MN孵育60 min。用Hank's溶液洗去未粘附细胞，再加入0.1 ml, 10 mmol·L－1 EDTA/PBS溶液解离已粘附细胞30 min，吸出解离液，用血细胞记数仪（FACSⅢ型，BD公司）计数MN数目，以粘附细胞占加入总细胞的百分率为粘附率。
1.5 ELISA方法[12] 
      融合内皮细胞单层经不同浓度烟碱预处理2 h，再经IL－1β诱导4 h，用PBS缓冲液洗涤3次，0.05％ 戊二醛固定3 h，2％NGS/PBS封闭2 h后，加入0.1 ml, 2 mg·L－1 AEmAb室温孵育3 h, PBS洗涤3次，加0.1 ml, 1:1000 HRP－IgG孵育2 h后, 用PBS洗涤3次，加邻苯二胺底物反应30 min, 用50 μl,2 mol·L－1 NaOH终止反应，在酶标仪(BIO－BAD450型)492 nm处测A值。
1.6 统计处理 
      所有数据用x ±s表示，并用Student－t检验或单因素方差分析进行检验。

2  结果
2.1烟碱对BCMEC 表达E－选择素的直接作用
      BCMEC对MN和NP有一定的基础粘附，较低浓度的烟碱直接作用于BCMEC后， BCMEC对MN的粘附率没有明显的增加，也无E－选择素的表达；而当高浓度的烟碱单独作用于BCMEC 2 h,可使其对MN粘附率增加, E－选择素的表达也有显著增加，二者增幅虽较小,但经t检验有显著统计学差异(见表1)，表明烟碱对BCMEC有一定的直接作用。
2.2 烟碱对IL－1β诱导BCMEC 表达E－选择素的影响
      IL－1β诱导的BCMEC对MN的粘附率和表达E－选择素的量均急剧增加。而BCMEC经烟碱预孵2 h后, 再经IL－1β诱导4 h，可使BCMEC对MN的粘附率较单纯IL－1β诱导组显著增加；E－选择素的表达作用也显著增强。AEmAb可明显阻断烟碱与IL－1β的共同作用。经单因素方差分析统计显示,烟碱的这种增强IL－1β诱导的粘附作用随浓度增大而增加，即具有明显的浓度依赖性 (见表 2)。 

3  讨论
      烟碱是烟草中主要的药理毒理学成分之一，它不仅是烟草成瘾的主要致依赖性物质，而且对心血管和呼吸系统有直接的毒性作用[4]。但烟碱及吸烟对心脑血管损伤的机理目前仍不十分明了。有研  究[13]表明，动脉粥样硬化的形成及脑缺血性疾病存在细胞粘附分子的过量表达，本研究探讨了烟碱对离体脑微血管内皮细胞表达E－选择素的作用。E－选择素作为细胞粘附分子选择素家族的主要成员之一，在机体受损伤或炎症状态下，被IL－1等免疫细胞因子诱导表达于血管内皮细胞膜表面，它在炎症、自身免疫性疾病、肿瘤细胞转移及淋巴细胞归巢等过程中起重要作用[7]；已有研究[12]显示，培养的内皮细胞在受到炎性介质(如IL－1,TNF等)激活1 h后即可合成E－选择素，4－6 h达到高峰，以后逐渐下降。在本实验中，IL－1β诱导BCMEC 4 h后，E－选择素有较高的表达，而烟碱可增强IL－1β的诱导作用,且AEmAb能非常显著地降低IL－1β诱导BCMEC后对MN的粘附，提示烟碱进入机体后可能具有加强E－选择素等粘附分子表达分泌的作用，进而促进白细胞滚动、粘附，在脑缺血性疾病的早期起重要作用。
      粘附实验是对在体血管壁受损伤或某些因素刺激诱导后与血细胞间反应的模拟，它能在一定程度上反映血管内皮与血细胞在形成动脉粥样硬化及引起脑缺血中的作用，可作为观察血管内皮和平滑肌细胞表达粘附分子的功能实验。粘附的形成和产生需要许多细胞因子和粘附分子的参与，IL－1β是人体免疫系统的重要因子，文献和本实验室的工作[5，6]均证实二者可诱导血管内皮细胞表达粘附分子，促进内皮细胞与MN等的粘附。本实验也显示烟碱对BCMEC有一定的直接激活作用，使BCMES与MN的粘附增加。
      结合文献[5,6]及我们的研究，烟碱增强脑血管内皮细胞表达粘附分子可能是其诱发脑血管疾病的机制之一，进一步的研究将为研究烟碱及烟草成瘾的脑血管毒理学提供理论依据。

4  参考文献
 1  Stolerman IP, Jarvis MJ. The scientific case that nicotine is addictive. Psychopharmacology, 1995，117(1):2－10.
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 7  Bevilacque MP, Nelson RM. Selectins. J Clin Invest,1993,91(2):379－387.
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10 杨景山，著. 医学细胞化学与细胞生物技术. 北京，北京医科大学中国协和医科大学联合出版社, 1990.1－31.
11 McCarron RM, Wang AL, Spatz SM, et al. Monocytes adhesion to cerebromicrovascular endothelial cells derived from hypertensive and normotensive rats. Am J Physiol, 1994, 267 (Heart Circ Physiol, 36): H2491－H2497.
12 Wong D, Dorovini－Zis K. Regulation by cytokines and lipopolysaccharide of E－selectin expression by human brain microvessel endothelial cells in primary culture. J Neuropathol Exp Neurol,1996,55(2):225－325.
13 Kasper HU, Schmidt A, Roessner A. Expression of the adhesion molecules ICAM, VCAM and ELAM in the arteriosclerotic plaque. Gen Diaga Pathol, 1996,141(5－6):289－294.

ENHANCEMENT OF NICOTINE ON EXPRESSION OF E－SELECTIN INDUCED BY IL－β IN CULTURED BOVINE CEREBRAL MICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLS

Xu Jiangping, Li Tiejun, Rui Yaocheng

(Department of Pharmacology, College of Pharmacy,Second Military Medical University, Shanghai, 200433)

ABSTRACT  Objective: To study the effect of nicotine on expression of E－selectin in cultured neonatal bovine cerebral microvascular endothelial cells(BCMEC). Method: BCMEC were cultured in vitro; IL－1β－induced endothelial adhesivity toward MN was studied using BCMEC; the adhesive cell number to BCMEC monolayers was counted by flow cytometry. E－selectin expression was measured by ELISA. Result: Pretreatment of BCMEC with nicotine (10－5 mol·L^－1) increased MN adhesion to BCMEC and increased E－selectin expression; but their amplitudes were lower. While BCMEC were treated with nicotine (10－7－10－5 mol·L^－1) and IL－1β (100 u·ml^－1), endothelial adhesion toward MN was increased significantly and enhanced E－selectin expression in concentration－dependent manner. Anti－E－selectin mAb might block partly nicotine－ and IL－1β－induced endothelial adhesivity toward MN. Conclusion: nicotine increases expression of E－selectin in BCMEC.
KEY WORDS  nicotine; vascular endothelium; monocytes; interleukin－1β; E－selectin

收稿日期：1998－10－14