1  基本原理

　　镇静催眠药是以其与苯二氮受体结合，激活GABAA受体引起神经细胞膜上氯离子通道开放频率增加或开放时间延长而增加氯离子的跨膜流动，出现神经元膜的超级化而降低神经元的兴奋性，造成中枢抑制。长期连续应用镇静催眠药，使中枢神经细胞产生适应性，一旦断药，神经细胞的代谢活动发生改变，功能发生变化，显著提高中枢兴奋性，大大增加对外界刺激的敏感性，出现一系列与镇静催眠药经典药理效应相反的戒断反应。

　　2  一般方法

　　镇静催眠、抗焦虑药的身体依赖性形成以后，在戒断期间发生一系列行为和躯体变化，而其最主要特点是反跳性兴奋。因而本法的要点是给动物较长时间的递增剂量用药，停药后观察自发出现的戒断症状(即自然戒断试验)，或者用诱导手段促其出现戒断症状。为了节省试验时间和避免试验周期长造成动物死亡，实验多用诱导法。目前常用的诱导刺激有阈下剂量的中枢兴奋药（如戊四唑35 mg·kg－1）和混频噪音铃声（8－12 kHz、105 db±s10 db）。

　　3  实验动物、给药方法和评价指标

　　镇静催眠药的身体依赖性试验所用的动物，国外报道的有大鼠、小鼠、猫、狗、猴、狒狒。根据我国国情，我们采用的实验动物主要有3种：小鼠、大鼠和猴。

　　3.1 小鼠

　　镇静催眠药的依赖性试验周期长，动物因药物的中枢抑制或运动障碍而造成体重下降，所以要特别注意选用健康的小鼠，开始试验时体重为25 g左右。给药途径以口服为主，溶于水的用饮水法（drinking solution），难溶于水的用药物掺食法（drug admixed food）。一般较少用小鼠进行自然戒断试验，对小鼠主要进行诱导戒断试验，试验期限为4－6周。

　　诱导依赖性小鼠戒断反应的刺激为混频噪音铃声。正常小鼠一般对铃声刺激不敏感，为天然听源阴性鼠。当小鼠形成依赖性后听到铃声可产生惊厥，称之为听源性惊厥。

　　阈下中枢兴奋药戊四唑（PTZ）亦可诱发依赖性小鼠出现惊厥。不论使用铃声或阈下剂量PTZ诱导惊厥都应在最后一次给药后的24 h进行。观察15 min，统计惊厥发生率。

　　3.2 大鼠

　　大鼠生活力强，不像小鼠那样容易死亡，适用于镇静催眠药身体依赖性评价的长期用药，开始试验可以用未成年鼠。

　　自然戒断试验和替代试验的给药方法主要用药物掺食法、饮液法，以避免给药操作损伤动物。给药时间10周以上。诱导戒断试验周期一般为4－6周，可采用灌胃或腹腔注射药物。

　　标准药苯巴比妥或地西泮用药物掺食法和饮液法喂养大鼠10或12周后，用正常食料或水（不含药）替代。大鼠在摄食不含药的食料和水后15 h出现戒断症状，24－48 h最重，72－96 h后逐渐恢复。症状有兴奋不安、嘶叫、食量减少、流涎、流泪、稀便、竖毛、颤抖、惊厥、体重下降、呼吸困难和死亡。目前戒断症状和评分尚无统一标准，评价的指标主要为体重下降，较为准确客观。受训药按照标准药的方法进行观察评价。

　　用听源性惊厥进行大鼠的诱导戒断实验应对大鼠进行挑选，因为正常大鼠的天然听源性惊厥阳性率为15％左右。所以在给药前应连续3 d进行每天1次的混频噪音铃声刺激，挑选3次刺激均为听源性惊厥阴性的大鼠用于铃声诱导戒断实验，长期给药形成身体依赖性后受铃声刺激就会出现惊厥。

　　阈下剂量戊四唑35 mg·kg－1可诱导有镇静催眠药依赖的大鼠出现惊厥。

　　对大鼠施行铃声刺激或阈下剂量兴奋药诱导戒断应在最后一次给药的24 h后进行，观察15 min，计算惊厥发生率。

　　3.3  猴

　　用云南、广西产的猴，均属恒河猴亚种。体重范围3.5－4.5 kg，雌雄兼用。经卫生检疫合格和驱虫治疗后进入实验室，分笼饲养。并且给小剂量抗结核药2周，预防出现结核病。然后休息2－3周，确保正常才可开始试验。

　　对猴给药均采用灌胃法。自然戒断试验和替代试验的周期为12－16周。受试药物的起始剂量的确定，一是通过药效学试验选取该药能引起猴嗜睡、步态蹒跚的中枢抑制剂量；二是参照阳性对照药的剂量，取其等效剂量。每天灌胃两次，灌胃后观察1－2 h，并且应根据中枢抑制程度调整剂量，如上午给药后猴中枢抑制重，下午给药前仍步态蹒跚，剂量应减半。每周称体重1次，递增剂量1次。若猴的耐受发展慢，可按原剂量继续给药一周。镇静催眠药试验的阳性对照药，巴比妥类选用苯巴比妥，起始剂量25－35 mg·kg－1，每周递增5 mg·kg－1；苯二氮类选用地西泮，起始剂量5 mg·kg－1，每周递增1－2 mg·kg－1。

　　苯巴比妥或地西泮依赖的猴在自然戒断期间出现的戒断症状比较多，一般在停药后d2出现，d3－5症状明显，严重时会出现死亡。体重下降可持续2周。由有观察经验的专门人员负责，每天至少观察1次戒断症状，连续2周。

　　猴的戒断症状通常分3级。轻度：过敏表情、兴奋不安、轻度震颤、竖毛、肌紧张、进食明显减少；中度：恶心、呕吐、流涎、流泪、颤抖、肌僵直、体重下降（10％）、极度不安、运动困难；重度：阵挛性或强直性惊厥、反应迟钝、呼吸困难、衰竭、死亡，参考阿片类依赖猴的戒断症状分值进行评分。

　　4  试验结果评价

　　镇静催眠药身体依赖性潜力评价试验的周期长，环境条件影响试验结果的可能性更大，所以更加有必要设立阳性对照组和阴性对照组。评价试验中通常需要设立4个试验组。一个阳性对照组（苯巴比妥或地西泮），一个阴性对照组（生理盐水或受试药的赋形剂），2个受试药组。每组猴4只左右，小剂量组的起始剂量为中枢抑制剂量；大剂量的起始剂量一般比小剂量大1－2倍（因这类药物的安全系数多为1－2）。

　　大、小鼠的诱导惊厥戒断反应，依据各组的不同惊厥发生率，进行组间率的显著性检验，受试药根据用药剂量大小和惊厥发生率与阴性对照组、阳性对照组的差异显著程度，判断受试药的依赖性潜力。

　　大鼠和猴的自然戒断反应，依据各组在各观察时间体重变化程度和戒断症状分值进行组间均数t检验，比较受试药组和对照组的差异显著程度，评价受试药的依赖性潜力。