可变数串联重复序列(Variable Number of Tandem Repeat, VNTR)通常由二个核甘酸组成的单元如“胞嘧啶＋腺嘌啉”(CA)经过若干次重复组成, 由于重复的次数(即n值)是可变的, 因而构成一种多态类型。在非严格定义的情况下, 也称为微卫星重复多态, 然而VNTR是从多态自身的结构特点来命名的, 而微卫星重复多态是从此类DNA在梯度离心分离时所表现的特性提出来的。VNTR是近年提出的概念, 因其在基因组中分布极为丰富, 故应用日趋广泛。就某一VNTR而言, 通常重复单元可以表现出几次到几十次不同的重复,并由此决定不同的长度类型, 因而其蕴含的多态信息量(PIC)较大。

      为了研究多巴胺D2(dopamine D2 receptor, DRD2)受体与酒精依赖的关系, 我们在研究中检测了DRD2的一种微卫星多态, 本文拟从方法学角度对此作一简单介绍。

1  实验方法

      PCR扩增: 所探测的DNA片段位于DRD2基因第二内含子内, 设计一对引物: A=5'－CAGGAGCACGTTTCTCATAC－3', B=5'－GGAGGGCGGTGCGGTCAT－3'。取滤纸片血痕(直径约1 cm)的1/8置无菌蒸馏水中浸泡15－20 h, 实验前在100 ℃孵育10 min, 骤冷后在德国产Herus－22R离心机上，采用Eppendorf转头，转速为每分钟3000转，离心1 min, 取上清液作为扩增对象。25 μl的聚合酶链式反应(PCR)混合物包括上述上清液10 μl, 一对引物浓度分别为2.5 pmol·μl－1, 50 mM KCl, 10 mM Tris－HCl (pH 9.0), 1.5 mM MgCl2, 0.1％ Triton－X－100(商标名, 非离子去污剂), 三种脱氧核苷酸dATP, dGTP 和dTTP分别为50 μM, 10 μCi剂量的 α－32P－dCTP ,  0.5 单位 Taq 聚合酶(Promega, USA)。在美国产MJ PTC－200型PCR仪上设计如下反应: 94 ℃变性30 s, 58 ℃退火45 s, 72℃延伸60 s. 最后一轮循环的延伸时间延长至6 min, 整个扩增过程为30个循环。

      电泳分离: 扩增完毕后, 采用瑞典Pharmacia公司 Macrophor 电泳仪, 以 0.1 mm 厚度的12％非变性聚丙烯酰胺超薄凝胶电泳分离, 分离条件为30V·cm－1×12 h。分离实验中, 以美国提供的经过检测的基因组DNA作为标准物, 标准物在美国通过Perkin－Elmer 373基因分析系统检测而确定基因型。实验中, 标准物和其它样本在相同条件下扩增。电泳完毕后, 将夹有凝胶的玻璃板用刀片分开, 由于玻璃板预先分别用结合硅油和剥离硅油处理, 凝胶将会完整地附着在以结合硅油处理的玻璃板上。

      放射自显影: 用普通电吹风机对附着在凝胶板上的超薄凝胶作简单的干燥, 为了预防凝胶剥脱卷曲, 吹风时应均匀并垂直向下, 并且不可过度干燥。剪裁1张略大于玻璃板的塑料薄膜覆于凝胶之上以防止放射污染。在暗室中, 将1张相应大小的X光片压在经塑料薄膜隔离的凝胶之上, 4 h后按常规方法显影。

2  结果与讨论

      结果如图1所示，图中，3，4二条带所示为标准品，其余为样本。通过标准品的对比，可以判断其它条带的长度并进而确定基因型。图中共显示出了4种不同的片段，长度分别为80bp、82bp、84bp和86bp，在各自的片段内，分别包括13至16次CA单元的重复，记作(CA)13、(CA)14、(CA)15和(CA)16。 2至7泳道所显示的基因型均由2个条带组成，相应的标记基因构成杂合子，而第1条带由2个86bp的片段组成，所以该个体为2个(CA)16标记基因所组成的纯合子。我们最初按一般序列分析的方法配制6％的标准变性凝胶, 虽然这种方法分辨率较高, 但上样时易发生尿素析出, 电泳后还需要脱尿素处理, 显得较为繁琐。由于我们的实验在于分辨2个碱基的差别, 其分辨率要求略低于序列分析, 所以改用12％非变性凝胶也可以得到确定的结果。

      VNTR多态由于广泛分布于人的基因组中，因而其应用越来越广。这里报道的仅是测定VNTR的一种方法，还有银染和荧光标记等多种方法，我们认为，每个实验室应根据具体条件选择合适的方法。本试验就是利用已有的序列分析系统开展的，不增加新的设备，从而节省了经费。

修回日期：1998－01－08

中国药物依赖性杂志

1999年 第8卷 第1期

[方法学介绍] VNTR检测技术   周儒伦   韦  丰   周朝凤   范建华 （北京医科大学第六临床医学院， 北京，100083）