摘要：研究吗啡依赖后大鼠脑内吗啡含量变化。对慢性染吗啡大鼠脑组织内的吗啡进行了原位免疫组织化学研究。染毒7d大鼠脑组织内未能检出吗啡，染毒14d大鼠脑组织内出现了强弱不一的免疫反应。大鼠对吗啡依赖形成过程中，脑组织内吗啡含量增高，且吗啡的分布与μ阿片受体分布一致。

    关键词：吗啡依赖 免疫组化 阿片受体

　　为研究吗啡依赖形成的机理，为与毒品相关死亡的鉴定开辟新途径，本研究对染毒大鼠脑组织内吗啡进行了免疫荧光检测。

    1 材料和方法

    1.1 试剂仪器

　　抗吗啡兔血清（美国Sigma公司）；FICT标记的羊抗兔血清（校免疫室提供）；盐酸吗啡针剂（沈阳制药厂生产，批号931028）；恒冷箱切片机（美国AO公司生产）；荧光显微镜（西德Opten－standard 18型）。

    1.2 方法

    1．2．1　动物分组　SD大鼠30只♂♀不限，体重150g±s20g,由我校实验动物中心提供，随机分为三组，每组又分为染毒组和对照组各5只，实验组分别染毒7d、14d、14d。

    1．2．2　染毒方法　染毒组按30mg．kg－1剂量吗啡，每日一次腹部sc，对照组给予等体积蒸馏水。

    1．2．3　检材准备　三组动物分别于最后一次染毒后1h、1h、7d处死，分别取大脑皮层、海马、纹状体、桥脑、小脑各一块，大小5mm×5mm×5mm,OCT包埋，恒冷箱－18 ℃下切片，片厚4μm，表于载玻片后自然干燥。

    1．2．4　实验方法　切片置PH7，4，0.01MPBS液中浸湿；加抗吗啡兔血清50μl（1:1500），37℃孵育30min,PBS冲洗3次；加FICT标记的羊抗兔血清50μl(1:24),4℃孵育30min,用PBS充分冲洗；加盖玻片，荧光显微镜下观察，照像。

    2 结果

    2．1 染毒7d组
　　
    各组织在荧光镜下与对照组无明显差异，组织结构不清，荧光染色不明显，呈土灰色，曝光时间大于2min(10×20倍放大)。

    2．2 染毒14d ,最后一次染毒1h后处死组
　　
    大鼠脑组织染色在荧光镜下与对照组明显不同。

    2．2．1 脑皮质　染毒组脑皮质的神经细胞，特别是相当于Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ层的神经细胞形态完整，着色均匀、柔和、呈强的黄绿色荧光，组织结构清晰，曝光时间30s (10×20倍)。对照组组织结构不清，仅有少量的显色较弱，分布不均的非特异荧光染色，曝光时间大于2min (10×20倍)。

    2．2．2 海马　染毒组可见清晰的组织及细胞结构，神经细胞着色均匀、柔和,呈强的黄绿色荧光染色，曝光时间30s。对照组无特异性荧光染色。

    2．2．3 纹状体　染毒组见团块状的神经细胞呈黄绿色的均匀、柔和、强的荧光染色，曝光时间25s(10×20倍)。对照组组织结构不清，无特异性荧光染色。

    2．2．4 桥脑　染毒组无明显的神经细胞染色，可见多数呈平行排列的条索状神经纤维呈强的、均匀、柔和的黄绿色荧光，曝光时间为40s。对照组无特异性荧光染色。

    2．2．5 小脑　染毒组镜下见三层组织结构清晰，浦肯野氏细胞着色均匀、柔和，呈强的黄绿色荧光，其余两层组织着色不明显，细胞结构不清，曝光时间40s。对照组组织结构不清，无特异性染色。

    2．3 染毒14d，最后一次染毒7d后处死组
　　
    各脑组织的免疫荧光染色与染毒14d，最后一次染毒后1h处死组相比，除荧光强度稍弱外，着色细胞及分布区域基本相同，曝光时间45s（10×20倍）。对照组无特异性荧光染色。

    3 讨论

    组织内吗啡的检测目前常有的方法是色谱分析及放免技术[1,2]，它们均有很好的灵敏度及特异性，但尚未见吗啡的原位免疫检测报道。本研究采用免疫荧光技术，对染毒大鼠脑组织内的吗啡的分布进行了原位检测，并探讨了吗啡依赖过程中脑组织内含量的改变。
　　
    一般情况下，sc吗啡，由于药物的代谢，48h后血、尿内几乎检测不出，但Votulani研究发现，血中吗啡的浓度不能反映脑组织内的含量[3]。Bhargava等进一步研究发现耐受大鼠脑组织不同区域内的含量有着明显的差异，且与非耐受动物相比组织内含量明显升高，其与血中含量的比值明显增大，且这种增大随着时间的推移而增加，因此，认为耐受大鼠脑组织内吗啡含量发生改变，脑内吗啡的清除减慢[2]。本研究连续给药7d的大鼠脑组织内无特异性荧光染色，这与我们前期对兔组织内吗啡的检测结果是一致的[4]。吗啡作为μ阿片受体的强激动剂，它与μ阿片受体的结合是相当牢固的，不易解离。而在机体依赖形成过程中，μ阿片受体与吗啡的结合能力明显增强[5]。本研究结果发现：吗啡与脑组织内μ阿片受体的分布一致，因此，我们认为本研究检出的吗啡主要是与μ阿片受体相结合的吗啡。染毒7d大鼠组织未检测出吗啡，可能与大鼠依赖尚未形成，μ阿片受体的数目较少或其活性较低，结合吗啡的数量较少，未达到本方法的灵敏度有关。另外，染毒14d，最后一次染毒7 d后处死大鼠组织尚能检出吗啡，可能与吗啡在中枢神经内蓄积及依赖有关。
     
    早在70年代，药理学家就证实了吗啡是与特异性受体结合而发挥作用的。其后，阿片受体在神经系统的存在亦得到了证实，且发现其在神经内分布是不均匀的，它不仅在细胞间有差异，而且在细胞内也有差异[6，7]，因而，人们认为吗啡在脑组织的分布亦有一定的差异。Mansour[8]等采用放射自显影技术对大鼠中枢神经系统阿片受体分布的研究发现，μ阿片受体主要分布于脑皮质的Ⅰ、Ⅳ层锥体细胞,海马的锥体细胞层，在纹状体内成团状分布。我们发现染毒14d大鼠脑组织吗啡的分布与μ阿片受体在中枢神经内的分布相一致。Candance等[9]用同位素示踪法证实，吗啡受体不仅存在于神经细胞膜上，也分布于细胞内微粒体部分，约有一半以上受体存在于线粒体和突触体，所以，在神经细胞体及其轴索内均有分布。本实验结果用免疫荧光方法从形态学角度证实了吗啡与μ阿片受体分布的一致性，显示了吗啡是μ阿片受体的特异性激动剂这一特点。并且不难看出，能够在细胞水平显示吗啡局部定位的免疫组化方法对慢性吸毒的诊断是一种较简便的有效方法。

    参考文献：

    1　Renland DJ,Trinler WA.The use of absorbance ration in high－performance liquid chromatography for the identification of drug abuse. Forensic Sci Inter,1988,37:37－46.
    2　Bhargava HN,Villar VM,Rahmani NH,et al.Distribution of morphine in brain regions,spinal and serum follow introvenous injection to  morphine tolerant rats.Brain Res,1992,595:228－234.
    3　Votulani J,Melzacka M,Adamus A.Changes in morphine pharmacokinetics in nervous and peripheral tissues following different scheduels of administration.Arch Int pharmacodyn,1983,265:180－191.
    4　陈梅珍，剂明俊，唐承汉. 兔组织内吗啡的免疫组织化学及HPLC分析研究. 西安医科大学学报，1994，15：327－329
    5　Phothman RB,Yang HY,Zrezo S.Upregulation of rat brain opioid receptors by chronic administration of tolerance and dependence.NIDA Res Monogr, 1991,105:433－443.
    6　Dahlstron BE,Paalzow LK.Pharmacokinetics of morphine in plasma and discrete areas of the rat brain.J Pharmacokin Biopharmacol, 1975,3:293－302.
    7　Fuller GN,Lin SN,Caprioli RN.Dose－related differential accumulation of morphine in specific regions of rat brain detetmined by mass fragmanttography.Int J Neurosci, 1988,38:31－38.
    8　Mansour A,Khachaturia H,Lewis ME.Autoradiographic differentiation of mu,delta,kappa opioid receptors in rat forebrain and midbrain.J Neurosci,1987,7:2445－2464.
    9　Candance BP,Solomon HS.Opioid receptor demonstration in nervous tissue,Sicence,1974,179:1011－1014.