【摘要】目的: 制备吗啡特异性单克隆抗体(mAb) 。方法:将吗啡分子与兔血清白蛋白或牛血清白蛋白交联,免疫BALB/ c 小鼠并检测免疫效价后,应用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗吗啡mAb。将纯化mAb 与胶体金颗粒交联后利用纸层析技术进行标本检测。结果:成功地制备了3 株抗吗啡mAb ,利用其中1 株抗体制备的胶体金试纸条,检测样品灵敏度达200μg/ L 。结论:吗啡mAb 胶体金试纸条研制成功将为毒品的现场检测打下基础。

　　关键词: 毒品滥用; 单克隆抗体; 胶体金

　　近年来, 毒品滥用已经成为一种严重危害社会的犯罪现象。其中, 鸦片、吗啡和海洛因及其衍生物为主要的毒品类型,他们的主要代谢终产物均为吗啡[ 1 ] 。对于毒品的检测, 目前常用的方法有色谱法[ 2 ]和免疫学方法[ 3 ] 。尽管色谱法能够精确定量, 但由于其通常需要贵重仪器, 且难以开展现场检测, 因此应用范围受限;而后者具有携带方便、耗时短及成本低廉等优点, 因此已成为目前常用的毒品滥用现场检测的手段。本研究中, 我们利用细胞融合技术制备了抗吗啡特异性单克隆抗体(mAb) , 并研制其胶体金颗粒的交联物。

　　1 材料和方法

　　1. 1 材料　四周龄雌性BALB/ c 小鼠和7 wk 龄雌性纯种新西兰大白兔,均由本校动物实验中心提供。同品系来源骨髓瘤细胞系Sp2/ 0 由本室常规冻存。吗啡盐酸盐购自中国药品生物制品检定所。牛血清白蛋白(BSA) 、福氏完全和不完全佐剂、HAT和HT 均购自Sigma 公司。兔血清白蛋白(RSA) 自制。免疫球蛋白亚类鉴定试剂盒购自Pierce 公司。氯金酸为上海化学试剂厂产品。FKTA FPLC 及蛋白G 亲和层析柱,均为PharmaciaBiotech 产品。PE支撑硝酸纤维素膜及玻璃纤维纸均购自What2man 公司。检测的样本(尿液)由西安市戒毒所提供。

　　1. 2 方法

　　1. 2. 1 吗啡白蛋白交联物的制备及检测　首先将吗啡与琥珀酸酐在无水吡啶中反应, 生成吗啡半琥珀酸酯(MHS) , 然后用氯甲酰异丁酯为缩合剂,将MHS 与RSA 或与BSA 结合,得到RSA2MHS 及BSA2MHS 交联物[ 4 ] 。以交联物常规免疫兔并检测其免疫效价。

　　1. 2. 2 抗吗啡mAb 的制备　mAb 的制备为本室常规技术[ 5 ] , 取RSA2MHS (3. 6 g/ L) 30 μL 稀释于生理盐水中共0. 25 mL , 加等量福氏完全佐剂研磨均匀后,皮下多点注射。21 d 后, 再取100μg RSA2MHS 加福氏不完全佐剂研磨均匀后皮下注射。分别于42 d 和56 d 后,取100μg RSA2MHS 腹腔注射加强免疫。45 d 后,取免疫小鼠静脉血进行效价测定。60 d 后常规融合, 包被BSA2MHS(5 g/ L) 以间接EL ISA 方法进行筛选, 取阳性孔以有限稀释法进行克隆化。扩大培养后常规制备腹水。

　　1. 2. 3 抗吗啡mAb 的鉴定　取制备的腹水进行抗体鉴定。①效价测定: 采用间接EL ISA 法。②Ig 亚类的鉴定: 按照试剂盒说明书进行。③特异性鉴定: 利用吗啡分子进行阻断实验。按照分子摩尔比计算抗体与游离吗啡分子的结合效价, 以20μg/ L 的吗啡分别与1∶104 和1∶105 稀释的mAb 室温作用10 min , 间接EL ISA 法检测。实验中以TNF2α与其特异性mAb 以及未阻断抗体作为对照。

　　1. 2. 4 吗啡胶体金交联物的制备及鉴定　以柠橼酸三钠为还原剂,按照文献[ 6 ]制备胶体金颗粒,并以电镜检测。将腹5 9 3 ISSN1007 - 8738 细胞与分子免疫学杂志(Chin J Cell Mol Immunol) 2003 , 19 (4)水以饱和硫酸铵沉淀过夜后, 做G蛋白FPLC 亲和层析。采用光电比色法, 确定mAb 与胶体金颗粒结合的最适稳定量后, 将纯化mAb 与胶体金颗粒交联, 并以超速离心法纯化。

　　1. 2. 5 尿样吗啡的快速检测　将BSA2吗啡交联物及兔抗小鼠IgG抗体分别划线于硝酸纤维素膜上, 作为样品检验区和质控区。将纯化后的胶体金颗粒附着于玻璃纤维滤纸上,并固定于硝酸纤维素膜的下端, 测试样品。

　　2 结果

　　2. 1 吗啡交联物的制备及检测　通过薄层法、熔点法及紫外分光光度法, 证明吗啡与琥珀酸酐反应产物为吗啡半琥珀酸酯(MHS) , 反应的靶点是吗啡的醇羟基。将MHS 与BSA 或RSA 物通过柱层析后用紫外分光光度法测得每个蛋白分子结合的吗啡分子数为(8. 0 ±0. 5) 个。兔抗交联物免疫血清的效价为1∶104左右。

　　2. 2 抗吗啡mAb 的制备及特性鉴定　常规免疫小鼠后,取脾细胞与Sp2/ 0 细胞融合, 融合率为98 %。融合后12 d ,取上清做间接EL ISA 检测到3 株阳性较强的细胞克隆。经过两次有限稀释扩大培养后, 得到3 株阳性克隆, 分别命名为3G10 、1E10 和6A3 。腹水做对比稀释后, 以间接EL ISA 检测3 株mAb 的效价分别为1∶1 ×106 、1∶3. 2 ×106 和1∶1. 6 ×106 。测得mAb 1E10 为IgG1 型,κ链。与对照组相比较, 1∶104 稀释的3 株mAb 均可被游离吗啡完全阻断。

　　2. 3 抗吗啡mAb 胶体金颗粒的制备　电镜结果显示,自制胶体金颗粒均匀, 直径约为15 nm(图1) 。测定mAb 交联的最适稳定量为35 mg/ L 。

　　2. 4 试制条检测结果　利用自制阳性样品和戒毒所提供阳性样品测定试制条敏感度为200μg/ L 。

　　3　讨论

　　免疫学方法检测小分子物质已经成为目前常用的手段。首先必须制备抗原特异性的mAb 或者多抗。由于mAb 的特异性使得其在应用中有着其他方法无法比拟的优点。毒品小分子为半抗原, 与分子质量较大的蛋白偶联后可以作为免疫原, 从而制备抗体。胶体金标记试制条主要利用的原理为竞争结合。原理如图2 : 质控区(C) 为兔抗小鼠的多克隆抗体,主要用于监测抗体是否失效; 测试区( T) 为兔血清白蛋白吗啡交联物。当样品带动试纸下端的胶体金颗粒向上迁徙时则阳性样品中抗体被特异性阻断, 不能够与T 区抗原结合, 显示为两条带, 而阴性样品则为一条带。美国食品及药物管理局(FDA) 将试制条检测的阳性指标定为300μg/ L[ 7 ] , 我们可以通过改善胶体金浓度以期达到此标准。据统计, 截止1995 年底, 我国登记在册的吸毒人员约有52 万人, 近年更是增长迅速。公安机关所破获的毒品案件中, 80 %以上与吗啡类毒品(包括鸦片、海洛因、吗啡等) 有关。吗啡胶体金试制条的研制成功将会使现场检测更加简便。同时, 由于本产品在公安、医疗、招工和征兵等领域都有着广泛的应用前景, 最终将会取得良好的经济效益及社会效益。

　　参考文献:

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