摘要 介绍了毛发中甲基苯丙胺（MAMP）及代谢产物苯丙胺（AMP）的GC/NPD、GC/MS的定性定量分析方法。毛发用0.1mol/LHCl水解，4－苯基丁胺（4－PBA）为内标，液－液提取，三氟乙酸酐（TFA）衍生化。毛发用量为10mg，检出限为GC/NPD0.5ng/mg，GC/MS0.1ng/mg，回收率大于78％。该方法成功应用于染毒豚鼠毛发中MAMP及其代谢产物AMP浓度变化过程的测定。

　　关键词 甲基苯丙胺 苯丙胺 毛发分析 GC/NPD GC/MS

　　体内滥用药物分析常用体液（主要包括尿液、血液）作为检材。近年来毛发分析愈来愈受到毒物分析工作者的重视。与体液相比，毛发具有易获取、稳定、易保存及不易作假等优点。体液中药物检出时限短（1～3d），适用于短期体内滥用药物的检测；毛发中药物检出时限长，分段检测可推断较长时间滥用药物的情况（视毛发长度而定）。两种检材的检测相结合，可以比较全面地评价被检者滥用药物的情况。

　　国外对毛发中滥用药物的分析已有很多文献报导［1－7］，主要是检测可卡因、吗啡、苯丙胺类及大麻等。苯丙胺类药物为人工合成的中枢神经系统兴奋剂，极易引起滥用。国内此类药物滥用呈上升趋势，但有关研究报导尚少见。

　　本文建立了毛发中甲基苯丙胺（MAMP）及代谢产物苯丙胺（AMP）的GC/NPD、GC/MS的定性定量分析方法。考察了不同水解条件、衍生化条件对毛发中MAMP、AMP提取效率及稳定性的影响。测定了单次及多次给药豚鼠毛发中MAMP、AMP的浓度变化过程。该方法简便、快速、灵敏，可很好地满足实际检案需要。

　　1　实验方法

　　1.1　动物实验

　　实验动物：豚鼠（普通级，400～500g，雄性，上海申旺实验动物场提供）,悬挂、分笼喂养。适应性喂养一周后,剃去背部中央的毛发（6cm×4cm）作为取样区,进行各项实验。

　　1.2　检测方法

　　1.2.1　仪器和试剂

　　仪器：HP 5988A GC/MS仪,HP5890GC(NPD)仪。

　　试剂：标准品MAMP、AMP、4－PBA（4－苯基丁胺，内标）购于Sigma公司及国家麻醉品实验室。

　　衍生化试剂TFA(三氟乙酸酐)、PFPA(五氟丙酸酐)、HFBA(七氟丁酸酐)购于Sigma公司，其它试剂均为国产分析纯。

　　1.2.2　色谱分析条件

　　GC/NPD:HP－1毛细管柱（12m×0.2mm），80℃(10℃/min)→280℃，进样口温度250℃，检测器温度250℃。

　　GC/MS:HP－1毛细管柱（12m×0.2mm），100℃(2min，25℃/min)→280℃；EI源；能量70ev；进样口温度230℃，接口温度280℃；离子源温度230℃；选择离子检测（SIM）:m/z154、140（MAMP、AMP）,m/z91（4－PBA）。

　　1.3　样品处理方法

　　毛发样品分别依次用0.1％十二烷基磺酸钠（SDS）、0.1％洗洁精、双蒸水和丙酮振荡洗涤一次，晾干后保存供检。

　　称取10mg洗净毛发，加1ml0.1mol/LHCl浸润，100℃水浴30min，冷却后加1μg4－PBA，用1mol/LNaOH调至pH11，3ml乙酸乙酯混旋提取，离心，有机层加一滴酸性甲醇(MeOH:HCl20:1)，45℃水浴下用氮气吹干后，加乙酸乙酯和TFA各25μl，密封，至微波炉（500W）衍生化2min,氮气吹干后加20μl乙酸乙酯定容，供分析。

　　2　结果与讨论

　　2.1　提取溶剂的选择

　　苯丙胺类为碱性、低分子量化合物，国外报导较多用氯丁烷作为提取溶剂，乙酸乙酯也较多被使用。本研究以兼顾提取效率、简化操作步骤为原则，进行以下比较实验：称取空白毛发10mg/份，分别添加AMP和MAMP各5ng/mg、50ng/mg，加1ml0.1mol/LHCl浸润，45℃水浴过夜，冷却后加1μg4－PBA，用1mol/LNaOH调至pH11,分别用环己烷、乙酸乙酯、氯丁烷、乙醚3ml混旋提取，余操作同样品处理项1.3。

　　称取阳性毛发20mg/份，提取操作同上。

　　分析结果如图1、图2所示。

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　　图1　不同提取溶剂提取MAMP/4－PBA面积比

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　　图2　不同提取溶剂提取AMP/4－PBA面积比

　　A空白毛发添加5ng/mg

　　B空白毛发添加50ng/mg

　　C、D、E阳性毛发1、2、3

　　实验表明：氯丁烷提取能力最强，但杂质干扰多，需增加净化操作步骤；乙醚提取杂质干扰少，但效率低；环己烷和乙酸乙酯提取杂质干扰相当，环己烷提取效率稍高，考虑到环己烷对可能存在的极性代谢产物(如对羟基代谢产物)提取能力有限，故采用乙酸乙酯作为毛发的提取溶剂。

　　2.2　水解条件的选择

　　毛发水解主要有三种方法：酸水解、碱水解和酶水解。Nakahara等［1］比较了酸水解（用MeOH：5mol/LHCl20：1超声水解后直接提取）与碱水解（2.5mol/LNaOH45℃过夜，乙醚提取）两种方法的回收率，发现差异不大，酸水解本底较低，操作也相对简便。但Kintz等［2］认为从调节pH值的角度来说，碱水解因可直接达到最适pH值而优于酸水解。为进一步优化水解提取条件，本研究进行以下实验：

　　称取阳性毛发20mg/份，分别按以下条件水解后提取或直接提取：

　　(1)加1ml0.1mol/LHCl浸润，45℃水浴过夜，冷却后余操作同样品处理项1.3;

　　(2)加1ml0.1mol/LHCl浸润，100℃水浴30min，冷却后余操作同样品处理项1.3;

　　(3)加1ml1mol/LHCl浸润，100℃水浴10min，冷却后余操作同样品处理项1.3；

　　(4)加1ml酸性甲醇（MeOH：5mol/LHCl20：1）超声水解、浸提30min，余操作同样品处理项1.3；

　　(5)加1ml1mol/LNaOH浸润，45℃水浴过夜，冷却后余操作同样品处理项1.3;

　　分析结果如图3、图4所示。

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　　图3　不同水解条件MAMP/4－PBA面积比

　　A阳性毛发1B阳性毛发2C阳性毛发3

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　　图4　不同水解条件AMP/4－PBA面积比

　　A阳性毛发1B阳性毛发2C阳性毛发3

　　实验表明:酸性甲醇（MeOH：5mol/LHCl20：1）超声水解、浸提，杂质干扰极多，需增加净化操作步骤；1mol/LNaOH水解杂质干扰也较多；0.1mol/LHCl45℃水解条件温和，但耗时较长；比较而言，0.1mol/L HCl 100℃水解30min，提取效率及杂质干扰情况均与0.1mol/LHCl45℃水解相当，且方便迅速。

　　称取空白毛发10mg/份，分别添加AMP或MAMP20ng/mg、50ng/mg，加1ml0.1mol/LHCl浸润，100℃水浴30min，冷却后余操作同样品处理项。另取AMP或MAMP200ng、500ng不经提取直接加酸吹干衍生化。GC/NPD、GC/MS分析结果表明，经上述条件水解后，MAMP、AMP均不发生分解，回收率稳定。因此0.1mol/LHCl浸润，100℃水浴30min为方便可行的水解条件。

　　2.3　衍生化条件的选择

　　苯丙胺类为含氮的低分子量化合物，用GC/NPD或GC/MS法检测时，经衍生化处理可改善色谱行为，提高方法灵敏度。常用的衍生化试剂包括醋酸酐、三氟乙酸酐、五氟丙酸酐、七氟丁酸酐等，也有实验室自行合成其他衍生化试剂。本研究用MAMP、AMP标准品(GC/NPD检测)比较了醋酸酐、三氟乙酸酐、五氟丙酸酐、七氟丁酸酐的衍生化效果，未见明显差异。衍生化常在加热（65℃左右）一定时间条件下完成。近年来微波衍生化技术越来越多地被采用。本研究用MAMP、AMP标准品(GC/NPD检测)比较了微波照射（500W，2min）与烘箱加热（65℃，30min）的衍生化效果，未见明显差异。

　　2.4　回收率

　　称取空白毛发10mg/份，分别添加5ng/mg、20ng/mgAMP和MAMP，按样品处理项操作，测得回收率见表1。回收率大于78％，能够满足实际检案需要。

　　表1　毛发中AMP、MAMP回收率的测定（n=6）

	添加量(ng/mg)	绝对回收率	CV(％)	相对回收率	CV(％)
AMP	5	96.39	4.11	106.48	8.93
	20	78.44	16.23	88.32	15.77
MAMP	5	95.33	6.34	104.92	5.74
	20	79.16	16.27	89.04	14.33
4－PBA	1μg	88.80	7.76

　　2.5　线性关系与最低检出限

　　准确取不同量的AMP、MAMP标准品，分别加至10mg空白毛发中，加入内标，配成系列标准样品，然后按样品处理项操作，分别用GC/NPD和GC/MS分析，毛发中AMP、MAMP的浓度与AMP、MAMP与内标的峰面积比成线性关系，其线性范围及最低检出限见表2。

　　表2　毛发中AMP、MAMP的线性关系及最低检测限

仪器方法	样品	回归方程	线性范围(ng/mg)	最低检出限(ng/mg)
GC/NPD	AMP	y=0.0051x＋0.0228r=0.9967	1～50	0.5
	MAMP	y=0.0113x＋0.0297r=0.9969	1～50	0.5
GC/MS	AMP	y=0.0041x＋0.0003r=0.9978	0.1～15	0.1
	MAMP	y=0.0075x＋0.0017r=0.9990	0.1～15	0.1

　　2.6　染毒豚鼠毛发中MAMP及其代谢产物AMP浓度变化过程的测定

　　2.6.1　单次注射MAMP豚鼠毛发中MAMP及AMP浓度变化过程

　　给豚鼠腹腔单次注射MAMP（30mg/kg，n=6，背部黑色毛发，给药前剃光），每天剃毛，连续10天，所得毛发按样品处理项操作，测定MAMP及其代谢产物AMP的含量，结果如图5所示。在给药后第二天MAMP及其代谢产物AMP的含量达到峰值，第五天后测不出MAMP，第七天以后测不出AMP。整个时间过程中，代谢产物AMP的含量均大于原体MAMP。

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　　图5　单次注射MAMP豚鼠毛发中MAMP及AMP浓度变化过程

　　2.6.2　多次注射MAMP豚鼠毛发中MAMP及AMP浓度变化过程

　　给豚鼠腹腔注射MAMP（20mg/kg，隔天一次，连续7次，n=6，背部黑色毛发，给药前剃光），隔天剃毛，连续10次，所得毛发按样品处理项操作，测定MAMP及其代谢产物AMP的含量，结果如图6所示。图中可见，首次给药后第十四天MAMP及其代谢产物AMP的含量达到峰值，第二十天以后测不出MAMP和AMP。整个时间过程中，代谢产物AMP的含量也均大于原体MAMP。

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　　图6　多次注射MAMP豚鼠毛发中MAMP及AMP浓度变化过程

　　参考文献：

　　［1］ Nakahara Y. Detection and diagnostic interpretation of amphetamines in hair［J］.Forensic Sci Int,1995, 70(1－ 3):135－ 153.

　　［2］ Kintz P,Cirimele V,Tracqui A,et al.Simultaneous determination of amphetamine, methamphetamine, 3,4－ methylenedioxyamphetamine and 3,4－ me－ thylenedioxymethamphetamine in human hair by gas chromatography－ mass spectrometry［J］.J Chromatogr B,1995,670(1):162－ 166.

　　［3］ Nakahara Y, Takahashi K,Shimamine M,et al. Hair analysis for drug abuse:I.Determination of methamphetamine and amphetamines in hair by headspace solid－ phase microextraction and gas chromatography with nitrogen phosphorus detection［J］.J Forensic Sci,1990:70－ 78.

　　［4］ Nakahara Y, Kikura R, Yasuhara M, et al. Hair analysis for drug abuse:XIV.Identification of substances causing acute poisoning using hair root. I.Methamphetamine［J］.Forensic Sci Int,1997,84:157－ 164.

　　［5］ R hrich J,Kauert G.Determination of amphetamine and methylenedioxy－ amphetamine－ derivatives in hair ［J］.Forensic Sci Int,1997,84:179－ 188.

　　［6］ Cheung S,Nolte H,Otton SV,et al. Simultaneous gas chromatographic determination of methamphetamine, amphetamine and their p－ hydroxylated metabolites in plasma and urine J. J Chromatogr B .1997,690(1－ 2):77－ 87.

　　［7］沈敏，沈保华、向平,等.血、尿中甲基苯丙胺以及代谢产物苯丙胺的分析研究［J］.法医学杂志，1997,13(3):129－132.