毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）是20世纪80年代出现的一种灵敏度高、应用范围广的分离技术， 被广泛应用于化学、医学、生化和药理学等各个领域。现以“CE”为主题词在“分析化学文摘”数据库查到的引文量超过4000篇，用同样的主题词和Altavista搜索引擎， 可在网络上查到2000余篇文献[1] 。CE的原理是基于Tiselius [2]的电泳理论，但在此基础上加快了分离速度，扩宽了分离物的范围，节省了试剂和分离液。 Weinberger等[3]在20世纪90年代首先将CE引入司法领域，他们证明了用这一技术分离包括纯化和非纯化的海洛因在内的18种违禁和管制药品的可能性。随着这一技术的推广应用，CE已成为违禁药品检测中的热点。本文简单介绍CE的特点、分离原理和分离模式，并就常见生物样品中滥用物质及其代谢产物的CE分离方法作一回顾。

    1 毛细管电泳

    1.1 特点

    与高效液相色谱(HPLC)相对应，毛细管电泳也称为HPCE，它具有以下一些优点：

    1.1.1 分离适用范围广 从无机离子到DNA片段，都可用于分离，尤其多用于分离生物多聚体如肽类、蛋白质、核苷酸、金属离子、无机离子及药物。

    1.1.2 多种分离模式 在同一硬件条件下提供毛细管区带电泳（CZE），胶束电动力学毛细管色谱（MEKC），毛细管色谱（CEC），毛细管等电聚焦（CIEF），毛细管凝胶电泳（CGE），毛细管等速电泳（CITP）等多种分离模式，可根据样品的不同理化特性，选择合适的分离模式。

    1.1.3 经济与HPLC相比，CE的样品用量只需几纳升，缓冲液只需几毫升，仅为HPLC的几百分之一。而且CE有很大的选择性，可以根据分子的性质（如大小，电荷数，手性，疏水性等）对极广泛的对象进行有效分离，为达到相似的目的，HPLC则要消耗许多价格昂贵的柱子和溶剂。

    1.1.4 分离效能高 通常理论塔板数n>105，灵敏度高（10－18－10－20mol·L－1），快速（分离大多不超过30min）。

    1.1.5 可与其他检测系统如质谱（MS）联用

    1.2 分离原理

    CE的硬件大致分为进样系统，分离系统和检测系统，见图1。

    顾名思义，分离在毛细管中进行。样品和缓冲液由进样系统注入，在毛细管内完成迁移后在远端的检测窗口出峰。常用的两种进样方式为流体动力学进样和电压进样。区别在于前者进样无特异性，而后者根据样品的电荷，离子移动性和离子浓度进行选择性进样。毛细管可提供不同长度和内径的规格，根据不同的分离目的还可选择使用硅胶涂层毛细管，多聚物涂层毛细管，未涂层毛细管或充入凝胶。常用的检测器有紫外检测器（UVD），激光发射荧光检测器（laser－induced fluorescence，LIF），电化学检测器等。UVD应用最普遍，灵敏度、精密度及线性范围均较好，但只能用于对紫外线有吸收的组分的检测。LIF的灵敏度更高（10－7－10－12mol·L－1），但CE现能提供的荧光波长有限。

    1.3 常用分离模式[4]

    1.3.1 毛细管区带电泳（CZE） CZE也称为毛细管自由溶液区带电泳，是毛细管中最基本也是应用最广的一种操作模式。溶液中的被检测物在电场的作用下根据不同的荷/质比发生迁移，带电荷数与电解液粘度呈负相关，总结为以下关系：

    γ=μeE。 γ： 迁移速度， μe： 电泳迁移率， E：电场；

    μe=q/6 πηr。 q：离子电荷数， η：溶液粘度， r：离子半径。

    在CZE模式中影响分离的最主要因素是缓冲液的成分和pH值。一种理想的缓冲液应该使电导率低（为了在高电压下不产生高电流）且对分离的干扰最小，常见的有磷酸、硼酸、柠檬酸、磷酸/硼酸缓冲液。CE应用最广泛的是蛋白质和肽类的分离，但由于会在毛细管表面产生ζ－电势造成区带扩展或分离失败，所以分离设定的pH值应高于被检物等电点1－2个单位，或者增加缓冲液的离子强度。 近年来，发展了涂层毛细管（即改性柱）。Andrews[2]报道用市场上的聚丙烯酰胺涂柱和聚乙烯醇涂柱成功地进行了1000多次CZE分离。

    1.3.2 胶束电动力学毛细管色谱（MEKC） CE中，液体相对于带电管壁移动会产生电渗现象，正离子的运动方向和电渗一致，最先流出，中性离子随电渗而行，负离子运动方向与电渗相反，因此，如果渗流速度的绝对值大于所有负离子泳流速度绝对值，则此混合物中的所有组分将朝一个方向迁移。在CZE中，中性物质在电渗的影响下具有同一迁移速度，不能获得分离。MEKC作为有利的补充在1985年被Terabe提出。

    在MEKC中，通常是将离子型表面活性剂加入缓冲液中，如果浓度足够大，则表面活性剂的单体结合在一起形成“胶束”。MEKC系统中，胶束相类似于色谱中的固定相，缓冲液的电渗流相当于色谱的移动相。溶质在这两相之间分配，由其在胶束中的不同保留能力而产生不同保留值。常用于MEKC的表面活性剂有十二烷基硫酸钠(SDS)、胆盐、亲水链季胺盐。

    在操作过程中另一重要因素即通过在缓冲液中添加有机溶剂来改变胶束的结构，以增加整个峰容量并提高分离效率。常用的添加剂有甲醇、异丙醇和乙腈。

    1.3.3 毛细管等电聚焦（CIF）和毛细管等速电泳（CITP） 众所周知，在电场作用下带电粒子将在电介质中作定向迁移，而对于类似蛋白质的两性电介质分子，其电荷状况视介质的pH值而异，当介质的pH值与蛋白质的等电点一致时，迁移就停止进行。CIF就是将一种两性电介质的混合物作为载体注入毛细管中产生pH梯度，施加电压后，混合物中各组分就分别停留在自身等电点对应的位置上，从而形成分离。

    CITP采用两种不同的缓冲液系统，一种是前导电介质充满整个毛细管，另一种是尾随电介质，置于一端的电泳槽中，前者的淌度高于任何样品组分，后者则低于任何样品组分，被分离的组分按其不同的淌度夹在中间，以同一速度移动，实现分离。

    2 滥用物质的检测

    2.1 阿片类

    阿片类药物是最常见的滥用药物。起初人们采用放免测定，但必须对阳性结果进行进一步的特异性检测，以分离出违禁与非违禁药品。对违禁药品的定量分析，常用气相色谱－质谱（GC－MS）联用。CE出现后以其快速、准确、微量和同时定量定性分析的特点引起了更多的关注。

    Wernly等[5]在1991年首先报道了CE测定尿液中的海洛因、吗啡、6－单乙酰吗啡（MAM）和美沙酮。之后他们又证明海洛因、吗啡和吗啡－3－葡糖苷酸在尿液中的主要代谢产物能用CZE分离。最近Taylor[6]等报道了CZE用于阿片类药物的定量分析。尿样含吗啉吗啡、MAM、吗啡、海洛因、可待因和二氢可待因。选用烯丙左吗喃（levallorphan）（DM Wood, UK出产）作为内标，用来校正进样方法本身带来的不精确。缓冲液用pH=6100mmol·L－1的磷酸氢二钠，毛细管用50μm×65cm的未涂层柱。12min内可获得完全分离，检测限在4－9ng·ml－1。电泳迁移时间的相对标准偏差（RSD）在1.1％ 或以下，邻近峰之间的分解>2，塔板数在20万以上；峰面积比的日内和日间重复性由RSD反映，在1％－4％ 之间。从使用者尿液中检出吗啉吗啡和二氢可待因的效果强于HPLC。文中还比较了电压进样和流体动力学进样两种方法，发现运用痕量富集的电压进样比流体动力学进样显示出更好的重复一致性。

    Lans等[7]报道了美沙酮和其原始代谢产物具有立体选择性，并用β环糊精作固定相分离了它们在尿液中的异构体。

    2.2 可卡因、大麻

    在Tagliaro[8]研究组最早的报道中，CZE用于吗啡和可卡因的检测，缓冲液用pH=9.2，50mmol·L－1硼酸溶液。头发样品（大约10mg）在0.25mol·L－1，45℃的盐酸溶液中孵育一晚，将混合物用液－液相萃取（LLE）后，在200nm的吸收光波长下同时分离可卡因和吗啡，或者分别用两种被检物的最大吸收光波长（可卡因：238nm；吗啡：214nm）以增强选择性。地卡因和丙烯去甲吗啡分别作为可卡因和吗啡的内标。两种被检物及内标都获得了很好的分离。分离效率高（理论塔板数为35万），重复性好（迁移时间日内RSD<1％，日间RSD<3％），定量分析准确度高（日内RSD在3％－5％范围中）。但是由于进样量小（几微升），CE的浓度敏感性不高，头发的检测限在0.2ng·ml－1以下。同一篇文献中提到用MEKC分析头发样品，缓冲液用100mmol·L－1 SDS＋25mmol·L－1硼酸＋20％ 甲醇，灵敏度比CZE稍差，而选择性稍高。

    对于大麻的检测，有报道对尿样水解液进行固－液相萃取（SPE）后，可用MEKC分离△9－四氢大麻酚（△9－THC）在尿液中的主要代谢产物。分离缓冲液用pH=9.1，75mmol·ml－1的磷酸－硼酸缓冲液，灵敏度达10ng·ml－1[9]。

    2.3 镇静催眠剂

    Boone等[10] 报道分别用CZE， MEKC分离了25种巴比妥盐。缓冲液CZE用pH=8.4，90mmol·L－1的硼酸溶液。 MEKC用pH=7.5，20mmol·L－1磷酸溶液＋50mmol·L－1 SDS。结果显示日内重复性差异CZE小于0.6％，MEKC小于0.5％。与气相、液相色谱相比具有更大的分离效果。

    Schafroth等[11] 报道了苯二氮类药物也可用CE分析，他用MEKC方法从尿液混合物中分离了8种常见的苯二氮类药物：氟硝西泮、地西泮、美哒唑仑、氯硝西泮、溴梦拉（bromazepam）、替马西泮、奥沙西泮和氯羟西泮，缓冲液是75mmol·L－1 SDS＋pH=9.3的硼酸－磷酸溶液及少量的有机改性剂（羟丙酸－β－内酯，甲醇和/或氰化甲烷）。作者还报道样品经酶水解和SPE试剂盒处理后，CE显示出的灵敏度高于现在的放免测定方法，使CE成为放免测定有利的补充工具。

    Tomita等[12]用MEKC同时分离尿液中硝西泮及其主要的两种代谢产物（7－氨基代谢产物和7－乙酰氨基代谢产物）。与尿液空白对照相比，得到3种被检物的分离峰型。 分离限在100－200ng·ml－1，相关性较好的达到10μg·ml－1，峰面积日间RSD 2.0％－7.7％ ，日内RSD 1.7％－8.0％，迁移时间日间RSD 1.0％－1.8％，日内RSD 0.2％－1.7％。

    2.4 苯丙胺类兴奋剂(amphetamine－type stimulant, ATS)

    ATS，近年来的滥用状况日益严重，大有超过海洛因的趋势。对ATS的检测应用较广的同样是先用放免测定筛选出阳性，再GC－MS联用分离。现发展的技术有HPLC, HPTLC和CE。

    Varesio 等[13]报道了苯丙胺、甲基苯丙胺、3,4亚甲二氧基苯丙胺（MDA）、3,4亚甲二氧基甲基苯丙胺（MDMA）和3,4亚甲二氧基乙基苯丙胺（MDE）同时分析情况。方法为在尿样中加入20mmol·L－1 的2－羟基－羟丙酸－β环糊精和pH=2.5，200mmol·L－1的磷酸缓冲液，吸收光波长200nm，LLE或SPE萃取方法都可以（后者的提取物更为洁净）。所有检测物与其对映体都在25 min内获得了很好的基线分离。迁移时间RSD 0.3％－0.4％，峰面积RSD 4.3％－9.1％（有内标），灵敏度在0.5μg·ml－1以上（但大多数严格的权威人士认为这点可疑）。

    Giulia[14]等报道用MEKC成功地分离了包括赛洛西宾（psilocybin，一种致幻剂），苯丙胺，苯二氮，大麻在内的18种禁用药。MEKC出峰大约是HPLC的两倍，但灵敏度小于HPLC。

    2.5 麦角酸二乙酰胺（LSD）、苯环利定（PCP）

    LSD在生物样品中的定量分离难度非常大，因为它在其中的有效剂量微乎其微，放免测定法由于会和其他分子产生交叉反应而缺乏可信性。现多用HPLC，LC－MS和CE－MS。Cai等[15] 报道用HPLC－CE 检测肝微粒体中的LSD及其代谢产物，并同时讨论了LSD和类似物的片段分离。

    PCP是Parke－Davis在1950年合成的一种解离麻醉剂，由于其严重的副作用而被排除在药物市场之外。60年代，PCP作为致幻剂逐渐流行起来。CE运用于PCP分离可通过提高电压，产生电渗流而使分子带电，根据电荷数和分子大小分离。Chen等[16] 建立了包括PCP在内的多种兴奋剂的定量定性分离。药物经放免标记，用CE的LIF检测器检测，分离只需不到5min，灵敏度达到1ng·ml－1。

    3 结语

    无论对于经过预处理的违禁药品还是生物样品中的滥用物质及其代谢产物，CE都是一种新的检测工具，这门技术融合了电泳和色谱技术，仪器设备简单，样品和试剂损耗小，能提供多种检测模式。目前出现的CE－MS联用方法是司法检测领域的重要补充，现已在市场上推广[17]。

    总之，虽然CE在滥用物质检测中的应用尚处于探索阶段，但其分离优势会使CE在这一领域中发挥独特的作用。

    参考文献:

    1 Tagliaro F, Turrina S, Pisi P, et al. Determination of illicit and/or drugs and compunds of forensic interest in biosamples by capillary electrophoretic/electrokinetic methods. J Chromatogr B Biomed Sci Appl, 1998, 713: 27－49.
    2 Kemp G. Capillary electrophoresis: a versatile family of analytical techniques. Biotechnol Appl， Biochem, 1998, 27:9－17.
    3 Weinberger R, Lurie IS. Micellar electrokinetic capillary chromatography of illict drug substances. Anal Chem, 1991, 63: 823－827.
    4 林炳承， 编. 毛细管电泳导论. 北京： 科学出版社, 1996. 83－159.
    5 Wernly P, Thormann W. Analysis of illicit drugs in human urine by micellar electrokinetic capillary chromatography with on－column fast scanning polychrome absorption detection. Anal Chem, 1991, 63: 2878－2882.
    6 Taylor RB, Low AS, Reid RG. Determination of opiates in urine by capillary electrophoresis. J Chromatogr B Biomed Appl, 1996, 675: 213－223.
    7 Lanz M, Thormann W. Characterization of the stereoselective metabolism of methadone and its primary metabolite via cyclodextrin capillary electrophoretic determination of their urinary enantiomers. Electrophoresis, 1996, 17: 1945－1949.
    8 Tagliaro F, Poiesi C, Aiello R, et al. Capillary electrophoresis for the investigation of illicit drugs in hair: determination of cocaine and morphine. J Chromatogr, 1993, 638: 303－309.
    9 Wernly P, Thormann W, et al. Confirmation testing of 11－nor－delta－9－tetrahydrocannabinol 9－carboxylic acid in urine with micellar electrokinetic capillary chromatography. J Chromatogr, 1992, 608:251－256.
    10 Boone CM, Franke JP, de Zeeuw RA, et al. Evaluation of capillary electrophoretic techniques towards systematic tox_icological analysis. J Chromatogr A, 1999, 838: 259－272.
    11 Schafroth M, Thormann W, Alleman D. Micellar electrokinetic capillary chromatography of benzodiazepines in human
urine. Electrophoresis, 1994, 15: 72－78.
    12 Tomita M, Kuyama TO, Sato S, et al. Simultaneous determination of nitrazepam and its metabolites in urine by micellar electokinetic capillary chromatography. J Chromatogr, 1993, 621: 249－255.
    13 Varesio E, Gauvrit JY， Longeray R,et al. Central composite design in the chiral analysis of amphetamines by capillary electrophoresis. Electrophoresis， 1997, 18: 931－937.
    14 Manetto G, Crivellente F, Tagliaro F. Capillary electrophoresis: a new analytical tool for forensic toxicologists.Ther Drug Monit, 2000, 22: 84－88.
    15 Cai J, Henion J. Elucidation of LSD in vitro metabolism by liquid chromatography and capillary electrophoresis coupled with tandem mass spectrometry. J Anal Toxicol, 1996, 20: 27－32.
    16 Chen FT, Evangelista RA. Feasibility studies for simultaneous immunochemical multianalyte drug assay by capillary electrophoresis with laser－induced fluorescence. Clin Chem, 1994, 40:1819－1823.
    17 Tafliaro F, Turrina S, Smith FP. Capillary electrophoresis:principles and applications in illicitdruganalysis.Forensic Sci Int, 1996, 77: 211－229.