摘要  目的：甲基苯丙胺（methamphetamine, MA）是近年来全球广泛滥用的毒品，对动物大脑DA和/或5-HT能神经元具有明显的毒性，本实验将进行动物研究，以探讨MA的神经毒性及5-HT转运体（Serotonin transporter, SERT）信使RNA（SERTmARNA）的表达。方法：Wistar雄性大鼠20只，质量（180±2）g，随机分为两组，每组10只，一组为MA实验组，另一组为对照组。实验组予MA（20mg/kg 8am 9pm， i.p×4天）制成亚急性中毒模型；对照组予等体积生理盐水。每组随机选5只在末次给药后7天经10%水合氯醛（30mg/kg）腹腔注射射麻醉，断头外死，剥离组织，经矢状位切开，随机取一侧半球，在冷冻切片机上行8um连续冠状切片，取含有纹状体、海马及额叶皮层等脑结构的切片备用，采用原位交技术检测上述脑区的SERTmRNA的表达。每组中另5只大鼠拉脱颈髓产断头，快速剥离脑组织，在冰上分离出海马、额叶皮层和纹状体，置液氮中速冻后，储存-70℃冰箱中备测。测定前将上述组织融化，称重，在超声匀浆机上匀浆，采用高效液相色谱法测定不同脑区的神经递质多巴胺（DA）和5-羟色胺（5-HT）。结果：给予亚急性中毒剂量的MA后，与生理盐水比较，大鼠额叶皮层、海马和纹状体的5-HT均有下降（P<0.05），3个脑区的下降率分别为58.09%、56.76%和25.51%；额叶皮层和纹状体的DA含量有一定降低（P<0.05），下降率分别为16.58%和22.28%，而海马的DA含量无明显变化（P>0.05）。上述脑区的SERTmRNA的表达均有一定程度的降低（P<0.05），分别下降60.87%、72.59%和36.50%。结论：MA对大鼠额叶皮层和纹状体的5-HT、DA秒统具有明显的神经毒性，并导致这些脑区的SERTmRNA表达的下调（即对其摄取位点的表达也产生毒性作用）。

　　甲基苯丙胺（methamphetamine, MA）是近年来全球广泛滥用的毒品，属于苯丙胺类兴奋剂，又称去氧麻黄素，在许多国家流行的“冰毒”（“ice”）就是MA的纯化形式，它具有药物依赖性（主要是精神依赖性）、中枢神经兴奋性、食欲抑制和拟交感效应等药理、毒理学特性，是联合精神药品公药管制的精神活性物质。已经知道MA对动物大脑DA和/或5-HT能神经元具有明显的毒性[1]，对人类大脑也具有潜在危险效应，但对这些效应及其病理学结果尚未充分认识。国外有关其神经毒性的报道。因此，研究MA的神经毒性，并寻找有效的保护性药物，从而防治提供一定的基础，已成为目前关注的研究热点。

　　5-HT摄取位点即5-HT转运体（Serotonin transporter, SERT）位于神经末梢突触前膜，其功能是重摄取突触间隙的5-HT进入突触前膜，直接影响突触间隙5-HT的浓度，并间接反是非曲直5-HT能神经纤维末梢的数量，SERT的减少在结构和数量上与5-HT能神经元的丢失一致。本实验将开展动物研究，探讨MA的神经毒性及SERT信使RNA（SERTmRNA）的表达。

　　1、材料和方法

　　设计：实验对照研究

　　地点和材料：动物：Wistar雄性大鼠20只，质量（180±2）g，购自四川大学实验动物中心，将动物随机分为两组，每组10只。实验前让动物在清洁恒温（室温18℃）恒温（相对湿度50%）饲养室适应3d，每天抓取一次，保持整个实验过程中自由饮水及进食和12h明暗交替光照。

　　药品和试剂：MA由中国药品生物制品检定所提供，用生理盐水溶解，给药体积为1ml/kg。10%水合氯醛（由四川大学华西医院药房提供，批号020524），用于动物麻醉。SERTmRNA原位杂交试剂盒购自武汉博士德公司。

　　实验地点：四川大学实验动物中心、四川大学华西医院分子病理实验室（四川省重点实验室）。

　　设计、实施者：四川大学华西医院精神药理学博士王雪讲师（接受过动物实验和分子病理实验的培训），评估者：四川大学华西医院病理科、临床药理研究室的资深教授（接受过相应培训），评估中采用了盲法。

　　干预措施：动物实验过程  随机选1组为MA实验组，另一组为对照组。实验组予MA（20mg/kg 8am 8pm,i.p×4天）制成亚急性中毒模型；对照组予等体积生理盐水。

　　每组10只大鼠中随机选5只在末次给药后7天经10%水合氯醛（30mg/kg）腹腔注射麻醉，断头处死，剥离脑组织，经矢状位切开，随机取一侧关球，参照《The rat brain in stereotaxic coordinates》（2），在冷冻切片机上行8μm连续冠状切片，取含有纹状体、海马及额叶皮层等脑结构的切片备用（3）。

　　将每组中另5只大鼠拉脱颈髓并断头，快速剥离脑组织，在冰上分离出海马、额叶皮层和纹状体，置液氮中速冻后，储存于-70℃冰箱中备测。测定前将上述组织融化，称重，在超声匀浆机（型号Sonics & materials.(203)-744-4400）上匀浆。

　　神经递质多马胺和5-羟色胺的检测  将前述匀浆置于高效液相色谱仪（HPLC）进行检测。方法如下：取用流动相稀的多马胺（DA）和5-羟色胺（5-HT）标准溶液100μ1（或大鼠脑组织100μ1），加入2ml离心管内，分别加入16ng/m12,4-二羟基苄胺（I.S）和10%HC104溶液30μ1，混匀，高速离心（12000/min，4℃）8min，取上清液100μ进样，记录色谱峰高，由标准高，由标准系列中5-HT（DA）与I.S的峰高比对浓度作标准曲线，求出回归方程。然后由样品中5-HT（DA）与l.S的峰高比在回归方程上求出浓度。

　　仪器与色谱条件：Waters510泵，Gilson141-ecd（玻璃碳工作电极，Ag-AgCI参比电极），U6K进样器，460电化学检测器，高速离心机，旋涡振荡器。江苏淮阴DROMASILC18柱（250mm×4.6mm,5μm），流动相为0.05mol/L NaAc-Hac(PH3.0)：CH3OH:0.05mol/L EDTA-Na2 (78:20:2)，流速1.0ml/min，每1L流动相加入十二烷基硫配钠100mg；氧化电压为0.69V。

　　SERTmRNA的原位杂交按试剂盒说明进行。

　　主要结局观察指标：给予MA后，两组纹状体、海马及额叶皮质的神经递质多马胺和5-羟色胺的含量变化及SERTmRNA表达的变化。

　　统计学处理：采用电子科大金盘公司的图象分析系统（Version8.0, GD-6）进行分析。并采用SPSS11.0统计分析软件的t检验和方差分析对数据进行统计处理。

　　2．结果

　　2.1  动物手术情况：动物实验过程中无动物死亡。

　　2.2  神经递质多巴胺和5-羟色胺的检测结果

　　重复给予甲基苯丙胺7d后，与生理盐水组比较，大鼠额叶皮层、海马和纹状体的5-HT均有下降（P<0.05），3个脑区的下降率分别为58.09%、56.76%和25.51%；额叶皮层和纹状体的DA含量有一定降低（P<0.05），下降率分别为16.58%和22.28%，而海马的DA含量无明显变化（P>0.05）。

　　表1  大鼠3个脑区5-羟色胺的检测结果（X±S n=5）（ng/g）

额叶皮层	t值	P值	海马	t值	P值	纹状体	t值	P值
盐水组	29.06±1.18	30.974	0.000	38.16±1.27	36.374	0.000	50.56±0.70	30.221	0.000
MA组	12.18±1.21*			16.50±0.39*			37.66±0.65*

　　*P<0.05，与盐水组比较，在统计学上有显着性差异

　　表2  大鼠三个脑区多色胺的检测结果（X±S n=5）（ng/g）

额叶皮层	t值	P值	海马	t值	P值	纹状体	t值	P值
盐水组	3.86±0.20	5.945	0.000	3.84±0.29	2.263	0.054	60.22±1.49	9.517	0.000
MA组	3.22±0.16*			3.46±0.24			46.80±2.78*

　　2.2  SERTmRNA原位杂交结果  给予MA 7d后大鼠额叶皮层、海马和纹状体的SERTmRNA的表达均有一定程度的降低（P<0.05），分别下降60.87%、72.59%和36.50%。

　　表3  大鼠三个脑区SERTmRNA原位杂交结果（X±S n=5）（阳性细胞个数）

组别	额叶皮层	海马	纹状体
盐水组	34.50±2.65	49.25±2.63	34.25±3.50
MA组	24.00±3.65*	34.00±3.56*	26.50±3.11*
t值	21.00	34.827	5.051
P值	0.000	0.000	0.002

　　*P<0.05，与盐水组比较，在统计学上有显着性差异

　　3．讨论

　　甲基苯丙胺与其它苯丙胺类物质一样具有苯环结构，由于有甲基而增加了甲基苯丙胺的亲脂性，使之易于进入大脑，能产生快速、强有力的效应。大量研究表明长期滥用MA对DA和/或5-HT能神经元具有明显的毒性[4]。最初关于MA诱导5-HT神经元毒性的研究发现：给予大鼠MA（4×25mg/kg/day，s.c），3周后有5-HT的耗竭，并有SERT的缺失[5]。MA诱导的5-HT神经系统的毒性与DA系统的类似。

　　给予MA处理后7d，与生理盐水组比较，大鼠额叶皮层、海马和纹状体的5-HT均有下降（P<0.05），3个脑区的下降率分别为58.09%。56.76%和25.51%，其中额叶皮层和海马的5-HT降低最明显，此下降率介于Ricaurte等报道的（MA 25 mg.kg-1×4d和MA 100 mg.kg-1×4d）之间[6]，因为我们使用的MA剂量也介于二者之间。

　　额叶皮层和纹状体的DA有一定降低（P<0.05），下降率分别为16.58%和22.28%，海马区DA变化不明显，这与多数学者的报道近似，他们的研究中仅纹状体的DA有明显降低，这可能与我们所选动物的种系、年龄、性别及给药方式有一定关系，但我们的实验中也是纹状体DA下降最明显。这些学者认为在不同的DA系统中，纹状体DA系统对MA的神经毒性作用最为敏感，并且DA的耗竭是由于DA神经纤维的破坏所致，并有直接的形态学证据[7]。Ricaurte等给予大鼠MA（4×25mg.kg-1day-1，s.c）21d后广泛脑区有5-HT的耗竭，并有SERT的缺失，这与DA的消耗具有区域特性（在新纹状体和黑质最明显）不同[6]，他们认为5-HT系统较DA系统对神经毒性剂的作用更为敏感。我们也发现在同样的脑区，5-HT的下降较DA的下降更为明显，与Ricaurte等的结果相符。

　　最初关于MA诱导5-HT、DA神经元毒性的研究发现：反复将高剂量MA给予大鼠，可致新纹状体DA的减少，本研究有类似发现。Fleckenstein等采用MA亚急性中毒模型，发现给药1h后纹状体突触对5-HT摄取减少50%，是MA的细胞内作用介导了毒性效应[8]。

　　MA是通过DA转运体和5-HT转运体进入神经末梢，置换出囊泡和细胞内的DA/5-HT，并通过H2O2和NO形成进一步的产物，从而导致细胞死亡[9]，由于大量地进行置换，从而耗竭神经末梢的DA/5-HT，导致DA/5-HT神经末梢的损害。

　　SERT位于神经梢突触前膜，不仅反映突触的信息传递，而且是5-HT能神经纤维末梢数量的间接反映，SERT的减少在结构和数量上与5-HT能神经元的丢失一致。本研究采用原位杂交方法（In situ hybridization，IHC），用已标记的寡核苷酸探针直接与组织切片中的目标核酸序列进行杂交，并对杂交信号进行检测，从而显示特异性SERTmRNA的分布和相对含量的改变，实验中采用多相寡核苷酸探针和高敏感标记技术，并配合使用敏感性加强型的检测方法，背景清晰，敏感性高。Ricaurte等给予大鼠MA（25和100mg/kg/day），并采用[3H]标记的5-HT研究体外摄取，6周后5-HT的摄取下降29%和51%[5]，我们用不同的方法研究5-HT的摄取位点，所得结果与之近似。以上结果提示：在额叶皮层、海马和纹状体的SERTmRNA的表达均有一定降低（P<0.05）。说明MA对广泛脑区的5-HT系统具有明显的毒性，不仅消耗大量的5-HT，还对其摄取位点的表达也产生毒性作用。

　　有关MA如何导致SERTmRNA表达的下调，其中涉及哪此机制，我们在下一步将进行深入的研究。

　　参考文献:

　　1. Davidson C, Gow AJ, Lee TH, et al. Methamphetamine neurotoxicity: necrotic and apoptotic mechanisms and relevance to human abuse and treatment [J]. Brain Res Brain Res review, 2001,36:1-10

　　2. Paxinos G, Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates, 1986; 2nd edition. Academic Press INC. (London) LTD, London. Figure1-25

　　3. 王雪, 彭祖贵, 况伟宏, 等. 3,4亚甲基二氧基甲基苯丙胺神经毒性的实验研究. 中国临床康复, 2004,8(31):6916-17

　　4. Davidson C, Gow AJ, Lee TH, et al. Methamphetamine neurotoxicity: necrotic and apoptotic mechanisms and relevance to human abuse and treatment. Brain Res Brain Res review, 2001,36:1-22

　　5. Ricaurte GA, Guillery RW, Seiden LS, et al. Dopamine nerve terminal degeneration produced by high doses of methylamphetamine in the rat brain [J]. Brain Res, 1982,235:93-103

　　6. Ricaurte GA, Schuster CR, Seiden LS, et al. Long-term effects of repeated methylamphetamine administration on dopamine and serotonin neurons in the rat brain: a reginal study[J]. Brain Res, 1980,193:153-156

　　7. Ricaurte GA, Seiden LS, Schuster CR. Further evidence that amphetamine produced long lasting dopamine neurochemical deficits by destroying dopamine nerve fibers[J]. Brain Res, 1984,303:358-361

　　8. Fleckestein AE, Haughey HM, Metzger RR, et al. Differential effects of psychostimulant agents on dopaminergic and serotonergic transporter function [J]. Eur J Pharmacol, 1999,382:45-49

　　9. Cubells JF, Rayport S, Rjendran G, et al. Methamphetamine neurotoxicity involves vacuolation of endocytic organelles and dopamine-dependent intracellular oxidative stress [J]. J Neurosci, 1994,14:2260-66