摘要 目的: 本文探讨甲基苯丙胺（MA）的精神依赖性神经机制。方法:采用条件性位置偏爱方法，大鼠脑内立体定位技术和脑内核团给药方法。利用ABC免疫组织化学方法来显示脑内不同部位即刻早期基因c－fos的表达情况。结果:将MA注射到伏核（NAc）内，在20，40，80 μg·kg－1剂量下对伴药盒产生了偏爱效应,且呈现出反相量效关系。而将相同剂量的MA注射到尾壳核（CPu）中，未出现位置偏爱效应。MA位置偏爱模型形成后可诱导伏核、隔核、额前叶皮质、梨状皮质、导水管背外侧和腹外侧亚区等部位出现Fos阳性细胞。结论:在MA的位置偏爱效应中NAc起重要作用。MA的偏爱效应可能与特定脑区c－fos基因的表达有一定关系。

    关键词 条件性位置偏爱 甲基苯丙胺 c－fos 伏核

    甲基苯丙胺（methamphetamine，MA）属于苯丙胺类中枢兴奋剂[1],俗称“冰毒”。有人利用苯丙胺类药物抑制食欲，以期达到减肥或控制体重增长的目的。但是随着苯丙胺类药物的长期滥用，其精神依赖性和严重的毒副作用问题也日益突出。这不仅给滥用者自身带来危害，也造成严重的社会问题。

    关于c－fos基因在动物不同脑区的表达情况与苯丙胺类药物的精神依赖性的关系国外报道较少，且结果也不很一致。

    本研究观察脑内特定核团注射与MA位置偏爱效应之间的关系，并用ABC免疫组化法测量大鼠脑内c－fos基因的表达情况。从分子水平初步探讨MA的精神依赖性机制。

    1 材料和方法

    1.1 动物

    Wistar大鼠，♂,220－270 g，北京医科大学动物部提供,符合国家Ⅰ级实验动物标准。

    1.2 药品

    甲基苯丙胺粉剂:国家麻醉品实验室样品，c－fos抗体，ABC试剂盒: 北京中山生物技术公司提供。

    1.3 实验装置

    1.3.1 位置偏爱箱[2]   主要由以下三个部分构成。隔音箱，位置偏爱盒（偏爱盒）和计算机。

    1．3.2 大鼠立体定位仪   日本，NARISHIGE。

    1.4 方法

    1.4.1 条件性位置偏爱方法

    偏爱条件: 光线: 20Lux，温度: 23 ℃±s 2 ℃，湿度: 55 ％±s 3％。

    训练程序: 在本实验室条件下，测试大鼠的天然倾向。将偏爱盒中的隔板打开，把大鼠放入中间地带，让其在偏爱盒内自由跑动，计算机记录50只大鼠在黑、白盒中的时间分别为576.6 s±s 156.8 s和295.4 s±s 154.3 s (P<0.05)，表明大鼠对黑盒有天然嗜好，所以在以后的训练阶段以白盒为伴药盒。即本实验采用倾向性程序。

    实验分两个阶段：第一阶段为训练阶段(8 d)。期间用隔板封闭黑白盒通道，实验组大鼠隔天给实验药放入白盒，隔天给生理盐水放入黑盒。而对照组大鼠连续8 d均给生理盐水，隔天放入白盒，隔天放入黑盒。所有大鼠每次在盒中停留的时间为50 min。第二阶段为测试阶段。测试日将中间隔板抬高，大鼠不给予注射，将其放入两盒中间，让其自由活动，用CPP95软件记录15 min内大鼠在两盒内分别停留的时间。一次实验周期为9 d。

    1.4.2 大鼠脑内的立体定位  

    首先用戊巴比妥钠40 mg·kg－1,ip麻醉大鼠，而后将其固定在大鼠立体定位仪上， 取平颅位， 充分暴露颅骨表面。核团定位[3]以前囟为参照，确定一侧核团的位置，用微型钻打开颅骨，而后通过立体定位仪的操作杆将内固定管(外径0.6 mm)插入脑内。NAc的内固定管定位:前囟前 2.0 mm， 前囟旁 1.2 mm;颅骨外表面下4.65 mm,CPu的内固定管定位:前囟前0.4 mm，前囟旁3 mm，颅骨外表面下2.65 mm。

    1.4.3 核团内给药

    手术后将大鼠单笼饲养3－5 d，再进行核团给药。微量注射器针头比固定管长1 mm。注射剂量：每百克0.1 μl，注射速度： 0.1 μl·min－1，注射完毕后使针头在内固定管中滞留1 min，再将其取出。整个实验结束后，将大鼠麻醉固定于立体定位仪上，进行颅部手术（步骤同前），打开颅骨，经升主动脉灌入4％多聚甲醛200 ml，先快后慢，取出包括注射部位在内的厚约5 mm的脑块，冰冻切片，Nissl染色，镜下观察注射部位是否准确，并将注射部位不准确的大鼠数据剔除。

    1.4.4 ABC免疫组织化学法  

    用戊巴比妥钠（50 mg·kg－1，ip）深度麻醉大鼠，经左心室－升主动脉插管，先灌注温生理盐水100－200 ml，先快后慢。再灌注4 ％多聚甲醛（0.1M PBS配制,4 ℃）350－400 ml，均先快后慢，约30 min。开颅取脑，放入4％多聚甲醛中，4 ℃下后固定4 h，再移入30％蔗糖溶液中，4 ℃过夜储存。再进行切片。最后进行Fos免疫组织化学染色。

    1.4.5 用SAS统计软件包统计分析

    对偏爱实验的各组数据分别计算均值和标准差（x ±s），再做方差分析，比较组间差异的显著性。

    将大鼠单侧8个片段不同脑区的Fos阳性神经元的数目计数，分别计算均值和标准差（x ±s），再做组间t检验。 

    2  结果

    2.1 核团内注射MA的偏爱效应

    2.1.1 NAc内注射MA的偏爱效应  首先将大鼠随机分组, 进行NAc内给药。对照组给NS, 实验组给MA。结果显示对照组在伴药盒中停留的时间为 289.5 s±s 125.7 s, 而 MA在20 μg·kg－1剂量[4,5]下于伴药盒中的停留时间为719.0 s±s 121.9 s (P<0.001), 提示大鼠对伴药盒产生了位置偏爱效应。并且随着剂量的增加,偏爱程度呈下降趋势, 表现出反相量效关系（图1）。

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图1　伏核内注射MA后的偏受效应与NS比较 *P<0.001

    2.1.2 CPu内注射MA的偏爱效应  将大鼠随机分组, 进行CPu内给药。 对照组给NS, 实验组给MA, 剂量分别为20,40和80 μg·kg－1。经方差分析, 表明各组间差异无显著性(P>0.05)，说明CPu内注射这三个剂量的MA均未产生偏爱效应（表1）。

表1　尾壳核内注射MA后的偏爱效应

    2.2 MA对脑内即刻早期基因c－fos表达的影响

    将大鼠注射MA（2 mg·kg－1, ip）或NS, 并按倾向性程序对其进行训练和测试。而后1 h内将大鼠处死，用ABC免疫组织化学法显示其脑内c－fos基因的表达情况。结果表明MA可诱导伏核、隔核、额前叶皮质、梨状皮质和导水管背外侧和腹外侧亚区的c－fos 基因表达。将大鼠脑片在光学显微镜下进行观察并照相。用网格型显微测微尺计数不同部位Fos阳性神经元的数目，每个部位取单侧8个片段，结果见表2。

    3 讨论

    中脑边缘多巴胺系统（MLDS）在精神兴奋剂强化效应中起重要作用。NAc是MLDS中DA能神经元的主要支配区域，含有大量的DA受体，其中D1受体尤为丰富。本研究将MA(20,40,80 μg·kg－1)注射到NAc中，结果有偏爱效应产生，且给药剂量与偏爱效应呈负相关。分析其原因（1）可能是因为MA的半衰期较长，可达十几个小时[6,7]。大剂量药物的强化效应尚未消失，再给NS放入非伴药盒时，大鼠仍能体验到药物带来的欣快感，从而扰乱了条件反射的建立，未能使伴药盒与大剂量的MA之间建立条件反射；（2）长期给予高剂量的MA可能导致VTA－NAc通路DA神经末梢损伤，从而降低NAc中DA水平。而NAc中DA含量与大鼠形成偏爱效应程度之间存在相关关系[8]，另外，本研究还选取注射到NAc中能产生偏爱效应的三个剂量（20，40，80 μg·kg－1）的MA注射到CPu中，结果均未产生偏爱效应。文献报道[9－12]将苯丙胺注射到黑质、CPu、杏仁核和疑核均不产生任何效应。本实验再一次证明，虽然脑内黑质纹状体DA通路的D1和D2受体的密度最高，但是其在MA偏爱效应中无明显作用，而NAc在偏爱效应中起重要作用。

    c－fos基因是即刻早期基因(immediate early gene, IEG)的一种。即刻早期基因的表达已作为一种神经元功能活动的标志应用于多种研究。目前对IEGs表达的产物，如 c－Fos和c－Jun的研究，是研究滥用药物在基因表达中作用的焦点[13]。

    从本研究可看到MA可诱导伏核、隔核、梨状皮质、额前叶皮质、导水管背外侧和腹外侧亚区的c－fos表达。中脑－边缘系统的DA通路与情绪调控有关，其中伏核、隔核、梨状皮质属边缘系统核团，这些部位c－fos的表达可能与MA的奖赏效应有关。中脑－大脑皮质DA通路与认知和推理能力有关。额前叶皮质c－fos表达说明该脑区处于活动状态，可能与大鼠学习建立条件反射有关。PAG背外侧亚区参与控制恐慌和焦虑，PAG腹外侧亚区则参与调控心血管活动[14]。这两个区域c－fos的表达可能与长期服用MA产生的焦虑及其心血管作用有关。而CPu中c－fos 无表达增加，与前面CPu内注射MA的结果相符。

    此外，这些核团c－fos的表达有强有弱，可能与不同脑区c－fos表达阈值不同有关，阈值低的部位Fos阳性神经元多，反之则少。这些脑区基础表达值的不同，也反映了fos表达阈值之间存在差异。

    通过本研究，认为今后应该在多种IEGs的反应时程和强度上进行分析研究，这样才能较全面地揭示第三信使在药物精神依赖中的作用机制。

    参考文献:

    1  郑继旺. 苯丙胺类兴奋剂的神经药理. 中国药物依赖性通报,1993,2：159－163.

    2  任燕华,刘忠华,张开稿.微机全自动程序控制的条件性位置偏爱实验系统.中国药物依赖性通报,1997,6: 26－29.

    3  包新民,舒斯云，著.大鼠脑立体定位图谱.北京:人民卫生出版社,1991.

    4  Tateyama M, Ohta S, Nagao T, et al. Inhibitory effects of 4－ phenyltetrahydroisoquinoline on locomotion and dopamine release induced by micro－injection of methamphetamine into the nucleus accumbens of the rat. Neuropharmacology. 1993, 32(8):761－766.

    5  Tateyama M, Ohta S, Nagao T，et al. Effect of 4－phenyl－1,2,3,4－tetrahydroisoquinoline on ambulation induced by injection of methamphetamine into the nucleus accumbens in rats. Neuropharmacology.1993,32(8):243－248.

    6  Cook CE， Pyrolytic characteristics, pharmacokinetics, and bioavailability of smoked heroin, cocaine, phencyclidine, and methamphetamine. NIDA Res Monogr, 1991,115: 6－23.

    7  Cook CE, Jeffcoat AR, Sadler BM. Pharmacokinetics of oral methamphetamine and effects of repeated daily dosing in humans. Drug Metab Dispos, 1992, 20(6):856－862.

    8  Spyraki C,Fibiger HC,Phillips AG. Dopaminergic substrate of amphetamine－induced place preference conditioning. Brain Res, 1982,253:185－193.

    9  Di Chiara G. In vivo brain dialysis of neurotransmitters. Tips, 1990,11:116－121.

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