摘要 目的：观察长期给酒精后大鼠不同脑区氨基酸类递质的变化，探讨吡拉西坦的作用。方法：以SD大鼠为实验材料，连续每天给20％酒精（10 ml·kg－1,ig,每日1次）6周，使其产生酒依赖，一组于给酒精第5周（在继续给酒精的同时）开始给吡拉西坦（200 mg·kg－1,im,每日2次），连续1周。采用高效液相色谱电化学检测法分别测定大鼠小脑、大脑皮层、海马和丘脑中的谷氨酸及γ－氨基丁酸含量。结果：连续给酒精6周后，小脑、大脑皮层和海马中的谷氨酸水平均有所降低，小脑中的变化显著(P<0.05)；γ－氨基丁酸水平除小脑中有明显降低(P<0.05)外，其余3区无显著性变化；谷氨酸与γ－氨基丁酸的比值在海马中显著降低(P<0.01)。吡拉西坦治疗组丘脑的谷氨酸水平明显提高(P<0.05)，小脑和大脑皮层的γ－氨基丁酸水平明显降低(P<0.01)，小脑、大脑皮层、海马3脑区中谷氨酸和γ－氨基丁酸的比值显著升高(P<0.01)。结论：连续给酒精对大鼠不同脑区谷氨酸和γ－氨基丁酸的含量以及二者的比值均有不同影响，吡拉西坦可在不同程度上逆转酒精的作用。
    关键词 乙醇； 谷氨酸； 氨基丁酸； 吡拉西坦

    长期饮酒可使机体对酒精产生依赖，酒依赖可严重损害神经系统的正常功能。大量研究表明，酒精对中枢神经系统的影响可能是通过不同的神经传递通路实现，或影响脑内某种递质的释放，或影响不同受体的功能。现代观点认为，依赖的概念应被理解为一种神经适应，而局限于某一特定系统的神经递质或受体的适应被称为“同源适应”。在酒依赖过程中，“同源适应”主要涉及两个系统，即谷氨酸(glutamate, Glu)和γ－氨基丁酸(γ－aminobutyric acid, GABA)系统[1]。本文采用高效液相－电化学检测法(HPLC－ECD)分析测定了长期给酒精后大鼠不同脑区Glu和GABA递质水平的变化及吡拉西坦的作用。

1 材料与方法
1.1 动物
    SD大鼠，♀，体重160－220 g（河北医科大学实验动物室提供，动物合格证号：医动字04057）。
1.2 仪器
    DIAX 900电动匀浆机（德国Heidolph公司生产），GL－16G－Ⅱ高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂生产），LC－10A高效液相色谱系统（日本岛津公司生产，含LC－10AT泵、L－ECD－6A检测器和CTO－10A柱温箱），WDL－95色谱工作站（大连化学物理研究所提供）。
1.3 药品与试剂
    吡拉西坦（pracetam）， 沈阳第一制药厂生产， 规格为20 ml:4 g，批号： 990404。 Glu标准品，上海政翔化学试剂研究所提供， 批号： 970228。 GABA标准品，美国Sigma公司提供，批号：107H05601。邻苯二醛，瑞士Fluka公司提供， 批号：394017/1 10699。甲醇，天津市康科德科技有限公司，批号：000301。乙腈，天津市康科德科技有限公司，批号：981123。其余试剂均为市售分析纯。实验用水为双蒸去离子水。
1.4 给药方法 
    取SD大鼠24只， 随机分为对照组(A)，酒精组(B)， 酒精＋吡拉西坦组(C)，每组8只。 B、C组给20％酒精（10 ml·kg^－1，ig）， 每日1次， 持续6周。C组于给酒精第5周后加用吡拉西坦（200 mg·kg^－1，im），每日2次，持续1周。A组ig与酒精同样体积的生理盐水（NS）。全部动物于末次给酒精24 h后用2％的戊巴比妥（2 ml·kg^－1，ip）麻醉，断头，于冰台上开颅，取出全脑，在冰冻人工脑脊液（ACSF）中迅速分离皮层、小脑、海马和丘脑4个脑区，称重后于－40℃冰冻保存。
1.5 样品处理
    各组织样品按一定比例加入冰冷的ACSF，冰浴条件下用电动匀浆机匀浆1 min。匀浆液低温离心(12 000 r·min－1,20 min)。取上清液100 μl，加入2.5倍量甲醇(99.8％以上)，混匀，离心(12 000 r·min^－1,10 min)。上清液稀释至合适浓度后备用。
1.6 HPLC测定
    采用柱前衍生化方法[2,3]。取样品液100 μl置聚乙烯塑料管中,加入20 μl衍生化试剂[50 mg 邻苯二醛溶于1 ml Na2SO3 (1 mol· L^－1)、1 ml甲醇(99.9％以上)和1.8 ml碳酸盐 (0.2 mol·L－1) 的混合液中]，混匀，室温反应10 min。色谱条件如下：色谱柱：YWG C18（10 μm，4.6 mm×250 mm，大连化物所提供）；流动相：醋酸钠－柠檬酸缓冲液（0.1 mol·L^－1）－甲醇－EDTA（0.01 mol·L^－1）－三乙胺（81：19：1：0.2），使用前经0.45 μm滤膜负压过滤，并超声脱气；流速：0.8 ml·min^－1。温度：35℃；电化学检测器：玻璃碳工作电极，Ag/AgCl参比电极，工作电压0.8 V。
1.7 统计方法
    各组实验数据采用t检验。

2 结果
2.1 连续给酒精6周后大鼠脑内Glu的含量变化及吡拉西坦的作用
    实验结果表明，与NS对照组比较，酒精组的小脑、大脑皮层和海马3个脑区内的Glu含量均有降低趋势，但小脑中的变化显著（P<0.05）。与酒精组比较，吡拉西坦治疗组丘脑内谷氨酸含量显著升高（P<0.05），其余脑区无显著性变化。见表1。
2.2 连续给酒精6周后大鼠脑内GABA的含量变化及吡拉西坦的作用
    实验结果表明，与NS对照组比较，酒精组小脑内的GABA含量显著降低（P<0.05），其余脑区GABA含量变化不显著。与酒精组比较，吡拉西坦治疗组小脑和大脑皮层内的GABA含量显著降低（P<0.01），海马和丘脑内GABA含量变化不显著。见表2。
2.3 连续给酒精6周后大鼠脑内Glu/GABA含量比值的变化及吡拉西坦的作用
实验结果表明，与NS对照组比较，酒精组海马内Glu/GABA比值显著降低（P<0.01），其余3脑区变化不显著。与酒精组比较，吡拉西坦治疗组的小脑、大脑皮层及海马内Glu/GABA比值显著升高（P<0.01），对丘脑内Glu/GABA比值无显著性影响，见表3。

3 讨论
    Glu是中枢神经系统内主要的兴奋性神经递质，对神经系统正常功能的维持起着重要作用。Glu通过激活受体参加从神经元传递到神经可塑性及神经病理异常等一系列生命过程[4]。有研究表明，在酒依赖形成过程中，Glu是中枢神经系统内对酒产生耐受性的重要递质之一[5]。GABA作为中枢神经系统内的主要抑制性递质，参与介导神经元活动的突触前和突触后抑制。有研究提示，GABA系统可能是乙醇作用于中枢系统的重要靶点[6]。Glu/GABA比值的变化可在一定程度上反应脑内氨基酸递质的平衡情况，并影响到神经生理功能的变化[7、8]。
    本文采用HPLC－ECD检测法分析测定了长期饮酒后大鼠脑内不同脑区Glu和GABA含量的变化。结果提示，长期给酒精大鼠的小脑、大脑皮层和海马3个脑区内的Glu水平有不同程度的降低，以小脑内Glu含量下降最为显著；酒精对大脑皮层、海马、丘脑的GABA水平无显著性影响，但可使小脑内GABA含量显著下降。对Glu/GABA比值的观察表明，连续给酒精可使海马、大脑皮层内Glu/GABA显著降低。这些结果表明长期给酒精对中枢的影响是以抑制兴奋性为主。试验结果还提示酒精对脑内不同核团氨基酸递质的影响是不同的，对小脑的影响最明显。有文献报道，长期饮酒可以引起GABAA受体基因表达的变化，使大脑皮层GABAA受体亚型α1、α2的mRNA表达减少，而使小脑中受体亚型α6的mRNA表达增多 [9]。本文测得小脑中GABA浓度降低，可能与α6受体亚型表达增多相关。 另外长期饮酒引起GABA转移酶活性的增加[10]也可能是小脑中GABA水平降低的原因。
    吡拉西坦为GABA的衍生物，可直接作用于大脑皮层，具有激活、保护和修复神经细胞的作用，是目前临床上常用的促智药物和神经保护剂[11]。在最近20 a的临床和实验研究发现，酒依赖者均有认知损害，这种缺陷包括信息处理减慢，注意力不集中，学习新信息困难，情绪异常和脱抑制，特别是容易受到损害并导致心理功能下降的脑区，包括小脑、边缘系统、间脑和大脑皮层[12]。调控学习、记忆的核团内GABA递度对学习记忆过程具有负性调节作用，脑内GABA水平的下降和Glu/GABA比值的升高可改善小鼠的记忆学习功能[13]。另有研究提示，吡拉西坦不仅能改善酒精所致的神经元损害，还可降低嗜酒鼠的饮酒量[14,15]。本研究结果证实吡拉西坦可部分逆转海马及大脑皮层因酒精所致的Glu和GABA水平的变化以及Glu/GABA比值的变化，提示吡拉西坦能通过调节神经递质水平而发挥对抗酒精对中枢神经系统的损害作用。本研究显示吡拉西坦可使小脑内GABA水平持续下降，其原因有待于进一步探讨。

4 参考文献
1 Littleton J, Little H. Current concept of ethanol dependence. Addiction,1994, 89:1397－1412.
2 Rowley HL, Martin KF,Marsden CA.Determination of in vivo amino acid neurotransmitters by high－performance liq_
uid chromatography with ophthalaldehyde－sulphite derivatisation . J Neurosci Methods,1995, 57:93－99.
3 Smith S,Sharp T.Measurement of GABA in rat brain microdialy astes using ophthaldialdehyde sulphite derivatization and 
high－performance liquid chromatography with electro－chemical detection . J Chromatogr, 1994, 652(2): 228－233.
4 梁秦川, 徐天乐 . AMPA和KA受体通道的分子结构和功能特性.生理科学进展, 1997, 28:352－355.
5 汤宜朗.酒依赖的形成机制及治疗药物研究进展.中国药物依赖性杂志, 1998, 7: 198－ 201.
6 Sherif FM, Tawati AM, Ahmed SS, et al. Basic aspects of GABA－transmission in alcoholism,with particular reference 
to GABA－transaminase. Eur Neuropsychopharmacol, 1997, 7(1): 1－7.
7 Labiner DM, Yan CC, Weinand ME, et al. Disturbances of amino acids from temporal lobe synaptosomes in human 
complex partial epilepsy. Neurochem Res, 1999, 24(11):1379－1383.
8 Dolina S,Peeling J, Sutherland G, et al. Effect of sustained pyridoxine treatment on seizure susceptibility and regional 
brain amino acid levels in genetically epilepsy－prone BALB/c mice. Epilepsia, 1993, 34(1): 33－42.
9 Morrow AL, Devaud LL, Bucci D, et al. GABAA and NMDA receptor subunit mRNA expression in ethanol dependent 
rats. Alcohol Alcohol Suppl, 1994, 2: 89－95.
10 Sherif F, Wahlstrom G, Oreland L.Increase in brain GABA－transninase activity after chronic ethanol treatment in 
rats .J Neural Transm Gen Sect, 1994, 98(1):69－79.
11 Stoll L, Schubert T, Muller WE. Age－related deficits of central muscarinic cholinergic receptor function in the mouse: 
partial restoration by chronic piracetam treatment. Neurobiol Aging, 1992, 13(1): 39－44.
12 Brandao F, Panla Barbosa MM,Cadete LA. Piracetam impedes hippocampal neuronal loss during withdrawal after 
chronic alcohol intake. Alcohol, 1995, 12(3): 279－288.
13 周红宇, 郑国统, 张士善.谷氨酸脱羧酶抑制剂－苹果酸对小鼠学习记忆的影响. 药学学报, 1996, 31: 897－900.
14田成华.酒精所致的神经及心理障碍.中国药物依赖性杂志, 1999, 8: 257－259.
15 Dienel A, Andreas K, Schmidt J. Influence of tropic drugs on drinking behaviour in ethanol－preferring mice and 
ethanol－induced increase of seizure susceptibility. Biomed Biochim Acta, 1985, 44(5): 767－771.

CHANGES OF AMINO ACID NEURO－TRANSMITTER LEVELS IN RAT BRAIN INDUCED BY LONG TERM ETHANOL TREATMENT AND FUNCTION OF PIRACETAM

HOU Yanning, LIU Jianfang, WU Honghai, LIU Huichen 

(Bethune International Peace Hospital, Shijiazhuang, 050082)

ABSTRACT Objective: To investigate the changes of glutamate (Glu) and gamma－amino butyric acid (GABA) contents in rat brain induced by chronic ethanol treatment and study the protective effects of piracetam. Method: 20％ ethanol (10 ml·kg^－1·d^－1, ig)was administered to rats for 6 weeks and piracetam (200 mg·kg^－1, im, twice a day) was given for 1 week starting in the fifth week of ethanol treatment.The contents of Glu and GABA in cerebellum, cerabral cortex, hippocampus, thalamus were detected by HPLC－ECD. Result:In ethanol treated rats,the Glu contents in cerebellum, cerebral cortex and hippocampus decreased, especially significant in cerebellum (P<0.05).There was no significant change in GABA level in the brains of chronic ethanol treated rats except that notable reduction of GABA content was observed in cerebellum. The ratio of Glu and GABA was significantly reduced in thalamus by chronic ethanol treatment (P<0.05). Piracetam treatment significantly increased the Glu levels in thalamus (P<0.05) and decreased the GABA levels in cerebellum and cerebral cortex (P<0.01). Piracetam treatment also increased the Glu/GABA ratio in cerebellum, cerebral cortex and hippocampus significantly (P<0.01). Conclusion: Long－term ethanol treatment could change the levels of Glu and GABA in some brain areas and piracetam may somewhat reverse the effect of ethanol.
KEY WORDS ethanol; Glu; GABA; piracetam
收稿日期:2000－11－21; 修回日期:2001－08－27

中国药物依赖性杂志

2001年 第10卷 第4期