摘要 目的：研究一氧化氮合酶抑制剂NAME和NABE的急性毒性对海洛因依赖小鼠的戒断症状的治疗作用并测定体内一氧化氮（NO ）的含量。 方法： 用NAME和NABE1000 mg.kg－1经灌胃及37.5 mg.kg－1静脉注射给药进行急性毒性实验； 采用海洛因递增法形成小鼠依赖模型（海洛因剂量从10 mg.kg－1增至50 mg.kg－1），皮下注射给药4.5 d，采用上述小鼠模型，观察NAME及NABE对海洛因依赖小鼠戒断综合征的治疗效果。结果：NAME和NABE在尾静脉注射37.5 mg.kg－1及灌胃1000 mg.kg－1剂量下未见明显急性毒性；NAME 16 mg.kg－1、8 mg.kg－1剂量组可明显延长戒断小鼠跳跃潜伏期，减少小鼠的戒断跳跃反应数，且抑制其腹泻症状，而NAME 4 mg.kg－1剂量组及NABE 8 mg.kg－1剂量组除对小鼠戒断反应的个别指标有影响外，其余作用均不明显；NAME对胸腺有一定的保护作用。NAME及NABE减轻海洛因依赖小鼠血液NO水平明显降低。结论： NAME及NABE毒性均较小， NAME减轻海洛因依赖小鼠戒断反应的作用较为明显。 
    关键词 NAME； NABE； 海洛因依赖； 戒断症状； 一氧化氮； 急性毒性； 小鼠

    一氧化氮（NO）近年来被证明是一种重要的神经信息物质，在中枢和周围神经系统中的重要性越来越受到人们的重视。它不仅在心血管、神经、免疫等系统中发挥重要调节功能，而且也可能介导了吗啡的镇痛作用。有文献报道[1]，外源性L－精氨酸可减弱吗啡的镇痛作用，而一氧化氮合酶(NOS)抑制剂L－NAME(N(1)－nitro－L－arginine methyl ester,N－硝基－L－精氨酸甲酯）可逆转L－精氨酸的作用。抑制NO合成可增强吗啡的镇痛作用。本文在国外有关报道的基础上[2]，采用小鼠海洛因依赖模型，对NAME及NABE(N(1)－nitro－L－arginine benzyl ester, N－硝基－L－精氨酸苯酯）治疗小鼠戒断症状的作用及其毒性进行观察，并初步探讨了NOS抑制剂NAME及NABE对海洛因依赖小鼠血液NO水平的影响。

1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 动物 昆明种小白鼠，♀♂兼用，体重18－22 g,中科院昆明动物研究所提供。
1.1.2 药品 海洛因：昆明市公安局提供（含二乙酰吗啡72.82％、单乙酰吗啡6.81％、乙酰可待因6.22％，提纯后经检验，含二乙酰吗啡85.35％、单乙酰吗啡6.59％、乙酰可待因6.50％）。临用时用适量浓度为0.1 mol·L－1的盐酸溶解后，再用生理盐水稀释至所需浓度，pH为6－7。NAME，批号97H0245；NABE，批号70H04761，由美国Sigma公司提供。盐酸纳洛酮： 北京四环制药厂提供原料，临用前用生理盐水溶解。NO含量测定试剂盒：由北京解放军总医院科技开发中心提供， 批号990408。
1.1.3 实验仪器 LD25－2自动平衡离心机：北京医用离心机厂；UV－2201型紫外分光光度计：日本岛津； XW－80 旋涡混合器：上海第一医学院仪器厂。
1.2 方法
1.2.1 NOS抑制剂NAME和NABE的急性毒性实验 小白鼠24只，平均体重20.5 g±s 1.6 g，♀♂兼用，按体重均衡原则随机分组，每组6只。
(1)灌胃（ig）给NAME、NABE组 给药剂量分别为1000 mg.kg－1,给药体积每20 g为1 ml （NAME、NABE用0.5％西黄氏胶液研磨成浓度为20 mg.ml－1的均匀悬液）。
(2)尾静脉注射NAME、NABE实验组 用75％的酒精棉球擦小鼠尾部，扩张其尾静脉，注射浓度为0.75 mg.ml－1的NAME和NABE，给药体积每20 g为1 ml （NAME及NABE用NS溶解）,相当于37.5 mg.kg－1。
    两组小鼠给药后观察7 d，记录动物死亡数。
1.2.2 海洛因依赖模型的建立及戒断跳跃实验 采用剂量递增法。海洛因剂量由10 mg.kg－1递增至50 mg.kg－1, sc,每日两次，每次递增5 mg.kg－1，共注射4.5 d,于末次注射6 h后ip纳洛酮5 mg.kg－1催瘾,跳跃反应发生率为90％。 
    小白鼠50只，按体重均衡原则随机分为5组，每组10只。
(1)海洛因对照组（HE组） 每天sc海洛因，于催瘾前30 min ip生理盐水。
(2)NAME及NABE组 各实验组每天sc海洛因，于催瘾前30 min ip NAME，剂量分别为4 mg.kg－1、 8 mg.kg－1、 16 mg.kg－1； ip NABE剂量为8 mg.kg－1。各组小鼠于末次注射海洛因后6 h ip 5 mg.kg－1纳洛酮催瘾，记录30 min内小鼠的跳跃反应次数，戒断反应前后1 h内体重变化，跳跃潜伏期及腹泻等症状。
1.2.3 NAME和NABE对海洛因依赖小鼠免疫器官的影响 小白鼠40只，按体重均衡原则随机分为4组，每组10只。除正常对照组外其余各组给药采用剂量递增法。海洛因剂量由10 mg.kg－1递增至50 mg.kg－1,共注射4.5 d。从注射d2起每次sc海洛因的同时分别ip NAME及NABE。NAME及NABE的剂量为8 mg.kg－1.d－1，分两次给药。到实验d5末次注射海洛因后6 h将小鼠全部处死，取出脾脏和胸腺称重并与正常组比较。
1.2.4 NO含量测定 取血方法：NAME、NABE和HE组在建立小鼠海洛因依赖模型后和正常组一同取血测定NO含量。取血前一晚上禁食不禁水，于次日清晨将小鼠用乙醚麻醉，眶静脉取血。 
    血样处理：取出全血置于加有适量肝素的抗凝管中，经离心后取上清液密封冻存于－20℃的冰箱中备用。
测定方法：按NO含量测定盒使用说明书操作，测定其硝酸盐的含量。
1.2.5 实验数据处理方法 各组数据用x ±s表示，并进行t检验。

2 实验结果
2.1 NOS抑制剂NAME和NABE急性毒性实验
7 d后所有小鼠全部存活，活动自如，进食正常，生长正常。
2.2 腹腔注射NAME及NABE对海洛因依赖小鼠戒断症状的影响
    一次性注射NAME 16 mg.kg－1可明显抑制小鼠的跳跃反应次数、体重下降并使跳跃潜伏期明显延长；剂量为8 mg.kg－1的NAME可明显抑制小鼠的跳跃反应，但对体重变化和延长小鼠跳跃潜伏期均无显著影响；剂量为4 mg.kg－1的NAME除对体重变化有影响外，对跳跃反应和潜伏期无影响；8 mg.kg－1和4 mg.kg－1两剂量组与对照组比较，跳跃潜伏期无统计学上的差异,(P>0.05)；结果显示16 mg.kg－1 NANM的作用明显强于8 mg.kg－1 和4 mg.kg－1两剂量组。
    一次性腹腔注射NABE 8 mg.kg－1组与对照组比较：除了对小鼠跳跃反应与对照组相比有显著性差异外，对体重变化及延长跳跃的潜伏期无明显影响，结果见表1。
    此外，NAME的3个剂量组及NABE一个剂量组均能缓解戒断后副交感兴奋引起的腹泻。用药组与对照组比较，小鼠的洗脸次数减少，另外扭体反应及尿多等现象均减少。 
2.2 NAME和NABE对海洛因依赖小鼠免疫器官的影响
    海洛因组与正常对照组比较,海洛因能使小鼠胸腺和脾脏明显萎缩（P<0.05）；海洛因(HE)组与NAME（8 mg.kg－1）及NABE（8 mg.kg－1）处理组比较,NAME组的胸腺指数显著升高（P<0.05）；NABE组的胸腺指数与HE组相比无显著性差异，提示NAME对胸腺有一定的保护作用。NABE组的胸腺和脾脏指数及NAME组的脾脏指数与HE组比较无显著性差异。结果见表2。 
2.3 NAME和NABE对小鼠体内NO含量的影响
    HE组与生理盐水对照组比较，HE组的NO含量明显高于对照组的NO含量（P<0.001）；NAME组（8 mg.kg－1）与NABE（8 mg.kg－1）组的NO含量明显低于HE组的含量(P<0.001)；NAME（8 mg.kg－1） 和NABE（8 mg.kg－1）组与正常对照组比较：NAME和NABE组的含量与对照组的NO含量无显著性差异(P>0.05)。 ip NAME(8 mg. kg－1)和ip NABE(8 mg.kg－1)均能使小鼠体内的NO含量明显降低，见表3。

3 讨论
    鉴于国内外对NAME及NABE的毒性研究均无报道，本实验在这方面进行了初步探讨。ig给NAME及NABE的剂量为1000 mg.kg－1,此剂量是本实验有效剂量(16 mg.kg－1 ）的62.5倍。在尾静脉注射实验中，其浓度采用0.75 mg.ml－1(相当于37.5 mg.kg－1),高于此浓度NAME及NABE不能完全溶解。从上述两方面情况初步可知，NAME和NABE的毒性较小。
    原本室已有研究报道[3]：海洛因提纯后可排除杂质易造成实验动物死亡的现象，成功地建立了海洛因依赖模型。但该报道所采用的溶剂为二甲亚砜，二甲亚砜可增加海洛因的吸收，但该溶剂本身对实验动物存在潜在的危险。本实验采用盐酸溶解海洛因，即加入少量盐酸来增加提纯后的海洛因的溶解度，然后再加入生理盐水，使pH维持在6－7。虽然本研究建立的模型跳跃率为90％，未达到所报道用二甲亚砜作溶剂时的跳跃率（100％），但由于本实验所采用的溶剂不会对实验动物产生影响，故该模型有较好的前景。本文结果表明NAME对减少戒断跳跃次数有效并呈一定的量效关系，研究结果与国外一致。而NABE在与NAME相同剂量时，作用不如NAME，这可能是结构上的差异所致。
    通过研究发现[4]，阿片类药物对免疫器官有一定的抑制作用，它对非特异性免疫功能、细胞免疫功能、体液免疫功能均有显著影响。海洛因可抑制体内B淋巴细胞形成抗体的能力，降低小鼠脾淋巴细胞空斑形成的数量，抑制体液免疫功能。而本实验NAME对海洛因依赖小鼠胸腺的萎缩有明显的对抗作用，NABE组的胸腺和脾脏指数虽未见统计学差异， 但有一定的上升趋势，可进一步增加药物剂量加以证实。吗啡抑制胸腺细胞增殖的效应较脾细胞明显， 胸腺指数明显减少，而脾脏指数仅稍许下降[5]， 本实验结果与该结论相吻合。
    由于NO在生物体内含量低，半衰期短，直接测定十分困难，因而在医学研究中常用测定NO代谢终产物亚硝酸盐和硝酸盐的间接测定方法。NO在血液中形成的亚硝酸根离子NO2－转变成硝酸根离子NO3－（1 h内>95％）。因此血液中的NO2－ 很低，血液本身干扰因素可完全屏蔽其比色测定，因此多用测定NO3－ 方法反映NO水平。本实验就是通过测定血样中的NO3－ 含量来反映NO水平的。
NAME和NABE属于L－精氨酸同类物。L－精氨酸是NO合成底物。L－精氨酸同类物通过竞争性占领L－精氨酸的结合部位，抑制NO的合成。本实验对小鼠NO水平的测定结果表明：NAME及NABE能使海洛因依赖小鼠体内NO含量明显降低。

4 结论 
    通过本文的研究结果表明，NAME及NABE均具有较小毒性，使其具有进一步研究开发的可能。NAME对海洛因依赖小鼠戒断反应的抑制作用较为明显，具有较高的研究及应用价值。 

5 参考文献
1 钟 慈, 孙安阳, 主编. 一氧化氮的生物医学.上海：上海医科大学出版社, 1997. 104－147.
2 Majeed NH, Przewlocka B, Machelska H,et al. Inhibition of nitric oxide synthase attenuates the development of 
morphine tolerance and dependence in mice. Neuropharmacology, 1994, 33(2): 189－192.
3 徐贵丽, 陈 力, 赵 晶, 等.褪黑素对海洛因依赖大小鼠作用的实验研究. 中国药物滥用防治杂志, 1996, (5): 13－17.
4 贾文祥, 蒋冬香, 王浴生. 阿片药物对机体免疫功能损伤. 中国药物依赖性通报, 1996, 5(2): 65－67.
5 陆正武, 林志彬.吗啡依赖小鼠免疫功能的变化.中国药物依赖性通报, 1994, 3(1): 4－7.

EFFECT OF TWO KINDS OF NOS INHIBITOR ON ACUTE TOXICITY AND WITHDRAWAL SYNDROME OF HEROIN－DEPENDENT MICE 

XU Guili, ZHAO Jing, LIANG Bing, WANG Zhipeng
(Pharmacy of Kunming General Hospital of Chengdu Military Region,Kunming,650032) 

ABSTRACT Objective: On the basis of acute toxicity, to study the effect of two kinds of NOS inhibitor on withdrawal syndromes including jumping reaction, weight loss of immune organ and NO level in plasma on heroin dependent mice. Method: The acute toxicity of NAME and NABE was studied with the dosage 1000 mg.kg－1 (po) and 37.5 mg.kg－1 (iv) . To establish a dependent mice model by gradually increasing doses of heroin (from 10 mg.kg－1 to 50 mg.kg－1 for 4.5 days); evaluate the scores of NAME and NABE in relieving withdrawal syndromes, weigh the immune organ and determine the NO level of plasma. Result: Both NAME and NABE produced no toxicity with the dosage of 37.5mg.kg－1 (iv) and 1000 mg.kg－1(po). NAME 16 mg.kg－1,8 mg.kg－1 could alleviate numbers of jumping, increase start jumping time and inhibit dirrhoea. NAME 4 mg.kg－1 and NABE 8 mg.kg－1 could partly inhibit withdrawal syndrome.In addition, other studies indicated that NAME could mitigate the decrement of thymus. Both could lower the level of NO content of heroin－dependent mice. Conclusion: Both NAME and NABE had little toxicity, NAME had obvious effect on the control of withdrawal syndrome of heroin dependent mice. 
KEY WORDS NAME; NABE; heroin dependence; withdrawal syndrome; NO; acute toxicity; mouse 
修回日期：2000－01－25

中国药物依赖性杂志

2000年 第9卷 第4期