目的：观察5-HT1A受体激动剂8-OH-DPAT和HT2受体拮抗剂利坦色林(ritanserin)对大鼠清醒和睡眠成分的影响，给予5-HT1A受体激动剂和剥夺REM睡眠后皮层5-HT2受体结合能力的变化，进一步分析两种5-HT受体亚型之间的关系以及5-HT2受体在睡眠中的作用。方法：利用大鼠睡眠自动分析系统定量分析清醒和睡眠成分的变化，注射PCPA制作剥夺睡眠的大鼠模型，水上平台法制作剥夺REM睡眠的大鼠模型，利用放射配体结合实验研究配体与受体结合力的变化。结果：8-OH-DPAT小剂量（0.01mg·kg-1,sc)可以增加深睡眠和浅睡眠，减少觉醒；大剂量（0.375mg·kg-1,sc）则增加觉醒，减少全部睡眠成分。5-HT2受体拮抗剂ritanserin可以明显增加深睡眠，减少觉醒和REM睡眠。而8-OH-DPAT低剂量与ritanserin联合用药则使深浅睡眠明显增加，清醒和REM睡眠明显减少，具有协同作用。对于PCPA化使3种睡眠成分均明显减少，觉醒比例明显增加的大鼠，ritanserin仅使浅睡眠增加其它成分不变。用［3H］-ritanserin放射性配基结合显示，剥夺大鼠REM睡眠后皮层5-HT2受体Bmax值明显增加但Kd值无变化；给予5-HT1A激动剂8-OH-DPAT后皮层5-HT2受体Kd和Bmax均降低。结论：5-HT1A受体和5-HT2受体与睡眠有密切关系，两种受体亚型之间也有一定联系，轻度激动5-HT1A受体或拮抗5-HT2受体均可增加深睡眠，同时激动和拮抗这两种亚型受体在减少REM睡眠和增加深睡眠方面具有协同作用，而减少REM睡眠显然在临床上是不利的。

　　1 材料和方法
　　
　　1．1 动物 ♂Wistar大鼠，体重300～400g，北京医科大学实验动物中心提供，在睡眠研究室内分笼饲养，食水自由。明暗周期12h/12h。室温(20±2)℃。
　　
　　1．2 仪器和材料 SN-2型脑立体定位仪，日本Narishige科学仪器实验室产品；NEC362八导生理记录仪，日本NEC三荣公司生产；模-数转换板(A/D板)，北京祥云计算机公司生产,a/D板型号p-1216k1,12位16通道，转换时间8.5μs，转换误差＜0.2％；486PC机；高速低温离心机（美国Beckman,J2-21型）；液闪测定计数仪（美国Beckman,DP5500型）；721分光光度仪（Perkin-Elmer公司）；恒温水浴槽（Formascientific公司）；液体快速混合器（江西医疗器械厂，YKH-I型）；真空抽滤器（美国Milipore公司产品）。
　　
　　1．3 药品及试剂 戊巴比妥钠：佛山市化工实验厂产品，临用前用蒸馏水配制成30g·L-1溶液。利坦色林（ritanserin）：美国RBI公司产品，临用前用酒石酸溶液配制。8-OH-DPAT：美国RBI公司产品，临用时以生理盐水溶液配制。螺哌隆（spiperone）：北京医科大学精神卫生研究所周东风教授馈赠，用体积分数为10％乙醇配制。PCPA：Sigma公司产品，临用前用以弱碱性溶液配制。［3H］-ritanserin：美国Dupont公司产品，2.22～3.33pBq*mol-1,临用时用体积分数为10％乙醇配制。Foline酚，北京医科大学生物化学系馈赠。牛血清白蛋白（BSA），上海生物化学研究所产品。2,5-二苯基口恶唑（PPO）和1,4-双-2-(5-苯基口恶唑)(POPOP)，北京生化技术公司产品。三羟甲氨基甲烷（Tris），北京华美生物制品公司产品。
　　
　　1．4 方法
　　
　　1．4．1 动物手术 ♂Wistar大鼠，戊巴比妥麻醉（30mg·kg-1，ip）后将头部固定于立体定位仪，无菌手术暴露颅骨，双氧水清洁颅骨表面，将4枚不锈钢表螺丝(直径2mm)作为脑电极分别埋藏在前囟前2.0mm后4.0mm中线左右旁开2.0mm处；用细铜丝做成肌电极和眼电极，其中两肌电极埋藏于颈深部肌肉，两个眼电极埋藏于大鼠一侧眼内外眦。将这些电极连接到一个九孔插座上，最后用牙托粉封固在颅骨上。术后给抗生素3d，恢复两周选择脑电稳定者用于实验。
　　
　　1．4．2 给药及大鼠睡眠记录和分析 记录前适应环境2d，使之建立起正常昼夜睡眠觉醒周期。重复给药至少间隔5d，以保证前一种药物作用消失。给药剂量是依据相关文献报道及本研究预实验结果。每只大鼠结果采用给药前后自身对照。每日10：00～16：00h进行记录，应用大鼠睡眠自动分析系统进行清醒和睡眠成分的定量分析（以所占总记录时间的百分比表示）。
　　
　　1．4．3 放射配体结合实验 皮层受体蛋白组织制备：大鼠迅速断头，冰浴下取出前脑皮层，称重，加入20倍体积的孵育缓冲液（pH＝7.6），匀浆。取2ml匀浆液在4℃离心45000×g，15min。弃上清，加入冲洗缓冲液，4℃下45000×g离心，15min，弃上清，加入孵育缓冲液，37℃水浴预孵育10min。重复匀浆、离心过程2遍。用pH7.0冲洗缓冲液制成400倍体积匀浆。每管取200μl待用(Yonedaetal,1987)。5-HT2受体分析：皮层粗膜上5-HT结合位点用［3H］-ritanserin定量测定。200μl组织液中加入［3H］-ritanserin20μl，在分别加入和不加spiperone(5mmol·L-1)20μl，液闪计数法测定结合力。非特异结合力即高浓度spiperone下的结合力，特异结合力为总结合力减去非特异结合力。将［3H］-ketanserin的浓度与特异结合值进行Scatchard分析，可求出［3H］-ritanserin结合的Kd和Bmax。Lowry法测定大鼠皮层受体蛋白浓度（林志彬,1992)。
　　
　　1．4．4 水上平台法剥夺大鼠的REM睡眠 平台直径为4.5cm，高出水面1cm。睡眠剥夺24h，每8h之间有20min自由食水时间(李德明,1981)。
　　
　　2 结果
　　
　　2．1 5-HT1A、5-HT2亚型受体与睡眠的关系 不同剂量的5-HT1A激动剂8-OH-DPAT（sc）,5-HT2受体拮抗剂ritanserin（ip）,以及二者联合用药对于大鼠清醒及睡眠成分的影响。
　　
　　结果发现低剂量8-OH-DPAT（0.01mg·kg-1，sc）可以明显减少清醒比例，增加浅睡眠和深睡眠比例，而不影响REM睡眠比例。高剂量8-OH-DPAT（0.375mg·kg-1，sc）可以明显增加清醒比例，减少浅睡眠、深睡眠和REM睡眠的比例。ritanserin（0.63mg·kg-1,ip）可以明显增加深睡眠，减少REM睡眠,而清醒和浅睡眠没有改变。低剂量8-OH-DPAT（0.01mg·kg-1,sc）与ritanserin（0.63mg·kg-1,ip）联合给药可以更明显的增加深睡眠和浅睡眠比例，而清醒和REM睡眠则明显减少，有一定的协同作用。
　　
　　2．2 ritanserin对PCPA化大鼠睡眠时相的影响 证明了5-HT2受体拮抗剂ritanserin在正常大鼠可以明显增加深睡眠和减少REM睡眠，现在研究它对化学性剥夺睡眠大鼠的影响。连续2d给大鼠注射PCPA（400mg·kg-1，ip）造成剥夺睡眠大鼠模型，给ritanserin（0.63mg·kg-1，ip）后观察清醒和睡眠成分的变化。从结果可以看出，PCPA连续2d腹腔注射，使大鼠各种睡眠成分均明显减少，而清醒成分明显增加，呈睡眠剥夺状态。对这种PCPA化的大鼠腹腔注射ritanserin只能一定程度恢复浅睡眠，而其它睡眠成分无明显变化。说明ritanserin在正常大鼠引起的深睡眠增加和REM睡眠的减少主要依赖于5-HT的存在。
　　
　　2．3 激动5-HT1A受体和剥夺REM睡眠后对皮层5-HT2受体配体结合的影响 在皮下注射高剂量（0.375mg·kg-1）或低剂量（0.01mg·kg-1）5-HT1A激动剂8-OH-DPAT1h后，以及水上平台法剥夺大鼠REM睡眠24h后，制备皮层受体蛋白，用［3H］-ritanserin作配体进行5-HT2受体结合实验，所获结果进行Scatchard分析并计算［3H］-ritanserin在上述两种条件下与5-HT2受体结合的Kd值和Bmax值。从结果可以看出，皮下注射低剂量8-OH-DPAT使大鼠皮层5-HT2受体Kd和Bmax值分别下降53％和30％；高剂量8-OH-DPAT使大鼠皮层5-HT2受体Kd和Bmax值分别下降51％和45％。说明激动5-HT1A受体对5-HT2受体数有一定的下调作用，但使亲和力增加（1/Kd）。在REM睡眠剥夺大鼠，5-HT2受体配体结合的Kd值无明显变化，而Bmax值增高52％，说明剥夺REM睡眠对5-HT2受体的亲和力影响较小，主要使受体数目增加。
　　
　　3 讨论
　　
　　研究清醒和睡眠成分的受体机制有重要的生理学意义和药理学价值。早期研究表明5-HT在睡眠调节中起着重要作用。用PCPA抑制脑内5-HT合成或电损伤中缝核，均可引起动物严重失眠(Jouvetm，1984)。但长期给PCPA尽管5-HT保持低水平，睡眠仍可以恢复(DementwCetal，1972)。
　　
　　近年来开发出几种5-HT受体亚型选择性激动剂、拮抗剂，又激发起人们重新研究睡眠与5-HT受体亚型的关系。放射自显影表明，大鼠前脑皮层的特殊层同时存在5-HT1A和5-HT2受体，而电生理研究也证明大鼠前脑V层锥体神经细胞上也有5-HT1A和5-HT2两个受体亚型存在。最近离体研究表明在中脑网状结构与REM睡眠有关的神经元，5-HT2激动后超极化，5-HT1A受体激动后去极化。5-HT1A和5-HT2受体均参与体温调节，但作用相反。
　　
　　JaimeMetal（1994)报道蛛网膜下腔注射8-OH-DPAT可能激动脊髓5-HT1A受体，减弱感觉传导，通过减弱网状结构上行激活系统增加睡眠。本研究证明小剂量8-OH-DPAT增加深睡眠和浅睡眠，明显减少清醒的比例，对REM睡眠无影响；大剂量则明显增加清醒，减少各种睡眠成分。
　　
　　现认为5-HT2受体与睡眠关系较为密切。5-HT2激动剂可以引起睡眠减少，而5-HT2拮抗剂可以引起睡眠增加。ritanserin是5-HT2受体拮抗剂中选择性较强，亲和力较高的一种，容易通过血脑屏障。在大鼠0.63mg·kg-1（ip）ritanserin对睡眠影响最明显，可占据前脑皮层80％的5-HT2受体结合位点,剂量再加大虽然占据位点增多，但也开始影响其它受体如H1受体，故本研究采用0.63mg·kg-1ip剂量(Leysenetal,1985)。本实验结果与jorvatnbBandUrsinR（1990）的报道很一致，即给予5-HT2拮抗剂ritanserin后大鼠深睡眠明显增加，REM睡眠明显减少。
　　
　　有人认为ritanserin调节睡眠可能是间接影响血压或体温来实现的，但更多的研究则予以否定（Awouterfetal,1988)。
　　
　　低剂量5-HT1A受体激动剂8-OH-DPAT和5-HT2受体拮抗剂ritanserin联合使用对睡眠成分的影响，尚未见有报道，本研究联合应用目的是为了揭示在睡眠调节过程中，尤其是在深睡眠（SWS）的调节过程中，5-HT1A和5-HT2受体体之间是否可能有协同关系。以往有研究表明低剂量8-OH-DPAT激动5-HT1A受体后脑电波功率谱变化与拮抗5-HT2受体后的变化极为相似，它们改变睡眠的模式也很相似。低剂量8-OH-DPAT的作用部位是突触自身受体，这有可能通过减少5-HT释放起到类似拮抗5-HT2受体起作用（Jaimemetal，1994)。本研究结果显示联合应用低剂量8-OH-DPAT和ritanserin后，清醒和浅睡眠成分变化类似于单独给小剂量8-OH-DPAT，深睡眠成分比单独应用ritanserin略有增加，REM睡眠则是极明显减少。REM睡眠的减少显然于临床用药不利，因为REM睡眠成分具有不可压缩性，否则停药后会引起强烈“反跳”现象。
　　
　　联合应用的结果提出了这样一个问题，即激动5-HT1A受体或剥夺REM睡眠后会对5-HT2受体有什么影响。对此本研究利用配体结合实验进行了初步探讨。结果显示，不论低剂量还是高剂量的HT1A激动剂8-OH-DPAT均可降低5-HT2受体与配体结合的Bmax，并增加结合的亲和力；剥夺REM睡眠不影响与配体结合的亲和力，而增加配体结合的Bmax。
　　
　　综合本研究的结果发现一有趣的现象：拮抗5-HT2受体后REM睡眠比例明显减少，加用小量5-HT1A受体激动剂后使5-HT2受体配体结合Bmax降低的同时REM睡眠比例减少更加明显，而剥夺REM睡眠后则使Bmax明显升高。这提示5-HT2受体数与REM睡眠所占比例之间有明显关系。