阿片类物质是最有效的镇痛药，被广泛用于临床麻醉和镇痛治疗。吗啡是阿片类物质的主要成分，它在机体内有广泛的作用，但其最主要的作用是缓解疼痛。阿片类物质主要与体内的阿片受体结合从而发挥镇痛作用，阿片受体主要存在于中枢神经系统和外周组织如免疫细胞内（1）。20世纪70年代，人们证实在中枢神经系统存在阿片类药物的内源性受体，并根据药理学试验结果把其分为三种亚型（μ、k和δ）。目前这三类阿片受体已经被克隆，他们都属于G蛋白偶联受体家族（2）。阿片受体的激活可以产生镇痛、镇静、欣快感、呼吸抑制以及其他作用。然而，长期给予阿片受体激动剂则可以促进机体耐药性及依赖性的产生。在大量的药理学及临床观察的基础上，认为μ阿片受体（MOR）是临床应用的镇痛药特别是吗啡的作用靶点（3）。药理学研究如对μ阿片受体基因敲除的研究结果显示：μ阿片受体在吗啡介导的镇痛、耐药性及躯体依赖性中起重要作用(4)。

　　μ阿片受体是位于小鼠第十号染色体上的一个单拷贝基因。目前，小鼠基因组的大部分片断已经被描绘出来，现在分子生物学家已经开始了辨别这些新发现连续基因功能的艰难任务。单基因敲除已成为一种日益普遍的基因工程技术来探索基因功能（5）。分子生物学家指出通过对野生型和基因敲除小鼠表现型的比较，可以判定一个靶基因的功能。而对大多数基因敲除小鼠的观察发现，最突出的表型改变为行为学改变（6）。因此μ阿片受体基因敲除的研究为μ阿片受体的研究开辟了一条新的道路，通过比较基因敲除小鼠与野生型小鼠的行为差别，使人们能够在整体动物水平研究μ阿片受体在镇痛及依赖性作用机制上的意义，还可能揭示阿片类药物的一些未知作用。本文对基因敲除技术以及μ阿片受体基因敲除小鼠某些行为学方面的改变作一综述。

　　一、基因敲除技术简介

　　1 、基因敲除方法   基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的一门新技术。它是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计试验，将该基因去除或用其顺序相近的基因取代，然后从整体观察试验动物，推测该基因的相应功能。其方法就是应用基因转移的方法将一段DNA转移到受体细胞内，转移基因可以取代受体细胞染色体基因组上一段长度相同的DNA片断，取代方法有随机整合与同源重组两种，同源重组即转移基因取代基因组上顺序相同或非常相近的基因。基因敲除可以用突变的基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。基因敲除最常使用的是小鼠的ES细胞(embryonic stem cells)，主要因为ES细胞在体外有白血病抑制因子的条件下，可以增殖并维持多潜能未分化的状态，ES细胞有利于各种体外操作，具有发育成胚系各种组织的能力。为获得基因敲除小鼠，应在体外构建一个靶载体。首先选定需要突变基因的全部或部分DNA序列，通过插入、修饰、删除或置换等手段使其突变，成为靶载体，将靶载体导入小鼠ES细胞中，使之与细胞染色体内同源的靶序列进行重组，达到定位突变细胞内该基因的目的。然后在细胞水平和分子水平筛选富集发生突变的细胞，并注射到小鼠囊胚腔内，将这些囊胚导入假孕母鼠子宫内。所产生的子代雄性嵌合鼠与正常雌鼠交配可获得生殖系携带该突变基因的纯合鼠。最后对纯合鼠的表型、基因型、基因表达及其产物等进行分析（7）。由于真核细胞中发生同源重组的概率非常低，如何把发生定点整合的细胞从大量随机整合的细胞中筛选出来，就成为基因打靶技术要解决的关键问题。目前已采用正负双向选择法(PNS) 、标记基因的特异位点表达法及PCR法，其中应用较多的是PNS法（8）。

　　2、基因敲除技术的优点和缺点  尽管单基因敲除技术为研究行为学机制提供了新的途径，但与其他技术相同的是，它也存在某些潜在的缺陷。例如，许多基因的产物对于机体正常功能的维持是必需的，若将此基因灭活将导致致命或严重的形态学或生理学的异常，从而使个别行为效应变得错综复杂。在某一基因灭活后，即使未发现明显的形态学、生理学或行为学的改变，意想不到代偿机制的参与从而模糊了该基因对行为的正常作用（9）。此外，行为实验仅研究丢失基因（以及其基因产物）的作用，并非基因本身的直接作用。最后，因为缺乏标准化的行为试验，所以很难将基因敲除动物的行为学评估进行对比（10）。而当前哺乳类动物基因组定位主要集中在小鼠，因此可以采用小鼠的标准化行为学实验。相对这些缺点而言，应用基因敲除小鼠在行为学的研究方面也有很多优势：1）灭活某一基因能提供非常精确和完全的切除2）在不伴有药物副作用的情况下，基因产物的作用被完全消除3）遗传技术可能是能够测定行为的众多内源性因素的确切作用的唯一途径。利用最新的可诱导基因敲除技术，可以控制靶基因定势和定位的破坏，因此其可能成为行为学研究的重要工具。

　　二、μ阿片受体基因敲除对小鼠行为学的影响

　　1、对运动功能的影响   μ阿片受体被认为是阿片类麻醉药如吗啡、海洛因的分子靶点，它介导产生镇痛及欣快感。同时，它还与体内各种生物学过程有关。利用同源重组基因敲除小鼠模型，可以探索此受体的一系列生理功能。

　　Mingting Tia等发现纯合子基因敲除小鼠发育正常，但是他们的运动功能已经发生改变。吗啡和其他阿片类物质可以增强啮齿类动物的自发性活动，自发性活动可以分为水平型（小鼠在观察笼内活动的范围）和垂直型（小鼠在观察笼内跳起的次数）。首次给药的纯合子小鼠表现出自发性活动的减少，而在野生型小鼠的观察中，自发性活动并没有因为吗啡的给予而发生改变。在观察中，未给予吗啡的纯合子小鼠的水平型自发性活动较野生型小鼠明显减少，当给予吗啡后，野生型小鼠的自发性活动增加，而纯合子小鼠的活动不受吗啡影响。在垂直型自发性活动的观察中，野生型小鼠在注射吗啡后活动明显减少，而纯合子小鼠无变化。提示μ阿片受体对吗啡有调节作用（11）。这些观察结果与Michael-Titus等在野生型小鼠的观察结果一致，吗啡可以增加水平型自发性活动，减少垂直型自发性活动（12）。

　　然而，与Mingting Tia等的观察结果不同，在小鼠Morris水迷宫试验中，Choon-Gon Jang等利用电视摄像机对MOR-KO和野生型小鼠自发性活动记录，以及利用计算机视频跟踪系统对两种类型小鼠水平型活动的分析，发现μ阿片受体基因敲除小鼠和野生型小鼠的自发性活动无差别（13）。

　　另外，在应用小鼠甩尾潜伏期（tail flick latency）测定小鼠阿片物质介导的抗伤害（antinociception）试验中，Mingting Tia等观察到与Matthes等观察结果相近的结果（13），在μ阿片受体缺失纯合子小鼠中，无吗啡诱导的小鼠甩尾潜伏期延长（12）。

　　2、对生殖系统的影响   Mingting Tian等在μ阿片受体基因敲除小鼠性功能的观察中发现，。然而，雄性纯合子小鼠的生殖系统仍然是有功能的，因其前列腺和精囊的重量与野生型小鼠相比无明显差异。但是纯合子小鼠的精子活动度和数量与野生型相比明显下降，这提示μ阿片受体的敲除影响精子的生成，即使雄性纯合子小鼠生殖系统的系统解剖没有改变(11)。

　　此后，Kevin Sinchak等发现μ阿片受体的激活在类固醇激素对雌性啮齿类动物的性行为（脊柱前凸lordosis）调节中起重要作用（14）。脊柱前凸行为是测试雌性小鼠性欲感受性的一种方法。以往的研究发现，内源性阿片肽、脑啡肽和内啡肽，对雌性小鼠生殖行为有调节作用（15）。Sinchak K等证实雌激素和黄体激素可使视前内侧核的μ阿片受体激活。雌激素激活的μ阿片受体抑制脊柱前凸行为，而随后给予的黄体激素则可以逆转雌激素对μ阿片受体的激活作用，从而促进小鼠脊柱前凸行为（16）。这与Kevin Sinchak等利用MOR-KO测定雌性小鼠性欲感受力的实验观察结果一致，MOR的激活，尽管是抑制作用，但在雌激素和黄体激素对性欲感受能力的最大促进作用的发挥也是十分必要的（14）。

　　总而言之，这些结果提示μ阿片受体在小鼠性行为和生殖生理方面起重要作用。μ阿片受体是否直接作用于生殖器官或对生殖功能有中枢调节作用还需进一步的研究（11）。

　　3、对造血系统的影响   动物实验证实阿片类对宿主防御反应系统有调节作用。例如，对μ和δ受体有高度亲和力的内源性阿片肽如内啡肽和脑啡肽都可影响造血系统中的成熟细胞，如单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞（17）。然而，目前尚未有研究证明μ阿片受体与造血系统之间的联系。为探索μ阿片受体在小鼠造血系统的潜在作用，Mingting Tian等对MOR-KO小鼠的骨髓、脾和血液内的髓样祖细胞进行观察，发现与野生型小鼠相比，纯合子小鼠骨髓粒细胞巨噬细胞集落形成单位（CFU-GM）, 红系暴式集落形成单位（BFU-E）, 粒红巨核巨噬系集落形成单位(CFU-GEMM)祖细胞绝对数明显增加，而骨髓和脾中的有核细胞以及血液中的粒细胞、红细胞及血小板计数无明显差别。并且，在野生型小鼠骨髓和脾内，髓样祖细胞处于缓慢的细胞周期性状态，而在纯合子小鼠，这些祖细胞则处于快速的细胞周期性状态。提示MOR与血细胞生成有关，且极有可能对其有负性调节作用，它可能直接或间接介导造血干细胞和祖细胞的生成，其确切联系尚需进一步的研究（11）。

　　4、对呼吸系统的影响    呼吸抑制是吗啡常见的副作用, 临床急性使用吗啡时需要密切观察患者的反应。Matthes 等报道给予镇痛剂量吗啡(6mg/kg) 野生型小鼠出现呼吸频率下降, 而MOR缺失小鼠呼吸指标没有改变（18）。

　　目前，已有大量的报告实例证明μ和δ受体间的相互作用（19），如在镇痛机制方面，阿片受体间的相互作用已经得到很好的证明。但我们对μ和δ阿片受体在呼吸控制和呼吸器官对麻醉性镇痛剂的反应上的相关性还不是很清楚（20）。μ阿片受体基因敲除小鼠的发展为解决这些问题提供了新的途径。Matthes等在μ阿片受体基因敲除小鼠中发现，呼吸器官对k阿片受体激动剂的反应不变，而其对δ受体介导的外源性受体激动剂的反应缺失。然而，当μ受体缺失时，δ受体在某些抗镇痛和呼吸功能方面的缺陷的起因还不是很清楚。不同神经元的不同受体间相互作用是不同的，因为δ受体活动性的改变是发生在区域性或功能性的基础上。例如，在μ受体缺陷小鼠，其输精管内外周性δ受体活动性并未受影响（18）。最近应用放射自显影对[35S] GTPgS的定量研究显示：在μ阿片受体基因敲除小鼠δ受体激动剂未能刺激[35S] GTPgS结合到尾状壳核和皮层上（21）。 至此，已部分明确了μ和δ阿片受体的相互作用。

　　而在对MOR-KO小鼠的研究中，Marie-Pierre Morin-Surun等发现由δ阿片受体激动剂引起的呼吸抑制作用减弱（22）。他们研究了μ和δ阿片受体在通气管理中的作用以及二者在脑干节律组织的相互作用。非限制杂合子和野生型小鼠在安静时表现出相似的通气模式，它们对高氧血症、低氧血症或高碳酸血症的化学感受反应也十分近似。在杂合子和野生型小鼠，利用纳曲吲哚阻断δ阿片受体既不影响通气模式也不影响同期对低氧血症的反应。δ2受体激动剂δ啡肽可降低两组小鼠的呼吸频率，而同样剂量的δ1受体激动剂脑啡肽明显降低杂合子小鼠的呼吸频率，却对野生型小鼠无效。

　　因此可以推论，μ阿片受体基因敲除对呼吸节律的产生、通气模式或化学感受调控无明显影响，先前在活体内观察到的δ2受体激动剂引起的呼吸抑制作用的消失，并不是缘于δ受体对脑干节律产生组织的直接反应。因这些组织结构表现为对δ2受体激动剂反应不变，而对δ1受体激动剂表现为放大反应（22）。

　　5、对学习和记忆功能的影响    过去的研究已经证实μ阿片受体的缺失可以导致由吗啡诱导产生的镇痛、呼吸抑制、便秘、强化效应和戒断综合症（23）。在一项放射性自显影的研究中，发现MOR-KO小鼠δ或k受体的表达无明显变化（24）。然而，已有报道与其他功能相关的神经递质系统的改变，如谷氨酸（glutamatergic）和多巴胺受体。 在MOR-KO小鼠的嗅球、伏核和尾状壳核的多巴胺受体D1和D2的mRNA表达增加（25）。这些结果提示随μ阿片受体的缺失，其他神经递质系统可能产生一种代偿机制。这些结果与MOR-KO小鼠的行为表型的改变相支持，与野生型小鼠相比，MOR-KO小鼠表现为在焦虑和抑郁方面的改变（26）。这些情绪性行为的改变可以导致学习能力的改变。事实上，先前的研究已经证实：μ阿片受体的缺失可降低海马齿状回的长时程增强效应（LTP）（27）,提示μ阿片受体的缺失可能伴随学习和记忆功能的改变。

　　已经被广为人知的是快速给予阿片类可以损伤学习和记忆功能（28）。此外，业已有报道，长期应用吗啡可导致记忆缺陷（29）。尽管这些缺损被认为与胆碱能系统的抑制有关（30），但其内在的机制还不清楚。而且，尚未有与MOR-KO小鼠记忆缺损相关的LTP缺陷的行为学的研究。

　　Choon-Gon Jang等应用Morris水迷宫试验，通过对野生型小鼠和MOR-KO小鼠反应的比较，验证了关于μ阿片受体的缺失对学习和记忆功能的影响（31）。其结果显示：与野生型小鼠相比，MOR-KO小鼠表现出明显空间记忆功能的缺损。这一结果提示μ阿片受体在空间学习和记忆功能中起重要作用。

　　基因敲除动物的应用为研究行为的遗传学基础提供了一种新的方法。重要的是，基因敲除的应用并不代表复杂行为可以由某一单基因控制。更确切地说，基因敲除仅提供有关行为机制方面的信息。撇除其众所周知的缺点，基因敲除技术已经对行为学机制提供了相当重要的见解。与此同时，基因敲除小鼠行为研究结果应该得到其他方法的确认，包括药理学方法。而且，标准化试验的发展同样有益于基因敲除动物行为学的进展（10）。总而言之，基因敲除技术将成为生物学家研究行为机制的重要工具。