【摘要】目的　研究洛非西定控制阿片类戒断症状的分子机理。方法　27只大鼠随机分为未干预组、洛非西定干预组（以下简称洛非西定组）、盐水对照组（以下简称盐水组），每组各9只。采用连续5 d吗啡腹腔内注射建立大鼠吗啡依赖模型，予洛非西定干预、纳洛酮促瘾后观察戒断症状，采用原位杂交实验观察桥脑蓝斑c-fos mRNA 核酸分子表达变化。结果　洛非西定组由纳洛酮催促的戒断症状总分［（84.3±4.6）分］低于未干预组［(156.0±10.0) 分］和高于盐水组［（0. 6±0.5）分］。洛非西定组蓝斑c-fos mRNA表达低于未干预组（q=4.96,P<0.01），高于盐水组。结论　洛非西定能抑制吗啡依赖大鼠蓝斑核c-fos mRNA的表达增强，使c-fos mRNA分子表达发生改变，从而对戒断症状产生控制作用。

　　【关键词】吗啡依赖 基因 fos 蓝斑 RNA 信使 洛非西定

　　洛非西定作为非替代治疗药物已广泛应用于阿片类药物依赖的临床治疗［1］，但对其减轻戒断症状作用的分子机理尚缺少研究。与阿片类药物依赖有关的中枢解剖部位很多，而位于脑桥上部第四脑室底上端的蓝斑是与阿片类药物躯体依赖以及戒断症状关系最为重要的解剖部位［2］。原癌基因c-fos被认为是细胞核内信号传导的“第3信使”,其在神经系统的信号传导中通过调节某些特殊基因的表达使短时程信号发挥长时程效应。我们采用核酸分子原位杂交技术测定吗啡依赖大鼠蓝斑神经元的c-fos mRNA分子表达在戒断中经洛非西定干预后的变化，旨在探索洛非西定治疗阿片类戒断症状的分子生物学机理。

    材料和方法

　　一、材料

　　清洁级健康雄性SD(Sprague-dawley)大鼠27只(由华西医科大学实验动物中心提供)，体积质量200～240 g，笼养于基本衡温、衡湿(22℃,70%湿度)，12 h昼夜交换的清洁饲养室内，实验前适应性喂养2天，整个实验过程中大鼠饮水及进食自由。将27只大鼠随机分为3组，每组9只，第1组为吗啡依赖未经洛非西定干预组（以下简称未干预组），第2组为吗啡依赖加洛非西定干预组（以下简称洛非西定组），第3组为盐水对照组（以下简称盐水组）。

　　二、方法

　　1.试剂与药品：洛非西定药粉（重庆医药工业研究所）、盐酸纳洛酮（北京四环制药厂）、盐酸吗啡粉(中国药品及生物制品检验所国家麻醉品实验室)、c-fos mRNA探针(华西医科大学生物化学与分子生物学研究室)， Dig-RNA标记盒(Boehringer)，蛋白酶K、RNaseA、NBT、BCIP、DEPC(Sigma)。

　　2.吗啡依赖大鼠模型的建立：根据Maldonado等［3］的方法，腹腔内注射盐酸吗啡2次/d(8:00,17:00)，连续5 d。剂量为第1 d：10 mg/kg ,15 mg/kg；第2 d：20 mg/kg ,25 mg/kg；第3 d:30 mg/kg ,40 mg/kg；第4 d:50 mg/kg, 50 mg/kg；第5 d：60 mg/kg, 80 mg/kg。盐水组每次腹腔内注射分别与上述相等容量的生理盐水。

　　3.洛非西定干预及促瘾： 于末次吗啡注射后2 h，对洛非西定组大鼠给予洛非西定0.4 mg/kg［4］腹腔内注射，未干预组和盐水组大鼠腹腔内注射相等容量的生理盐水。所有大鼠于注射后30 min给予盐酸纳洛酮2 mg/kg腹腔内注射，进行促瘾实验。

　　4.戒断症状的观察：根据国际通行的吗啡依赖大鼠戒断症状观察法［5］观察戒断症状。将注射纳洛酮后的大鼠立即放入特制的直径30 cm,高35 cm的圆柱形容具中观察30 min。戒断症状指标包括2部分，第1部分为跳跃、湿狗样颤抖、前爪震颤及咀嚼等4项，观察30 min内上述现象出现的次数；第2部分为每5 min为一段时间，每段时间有症状时评1分，最高为6分，包括叩齿、腹泻、躯体震颤、上睑下垂及体积质量下降(%)5项。于注射纳洛酮后2 h内，采用断头法处死大鼠。分离出大鼠的桥脑部分固定、脱水，连续冠状冰冻切片，厚度为20 μm。抽取部分切片，经HE染色后在光镜下确认蓝斑［6］。

　　5.c-fos mRNA杂交实验：切片预处理、预杂交、加入新鲜配制的杂交液（含 c-fos mRNA 探针 2 μg/ml）50 μl/片，置于湿盒，放入42℃孵箱中孵育16～20 h,反复漂洗、加入碱性磷酸酶标记的抗地高辛IgG（1: 500稀释度）室温下孵育 3 h、冲洗、显色、二甲苯脱水、中性树胶封片。

　　6.读片：采用视野评分法［7］，每只大鼠取2张脑片，在10×10放大倍数下，每1张切片用目镜网格任选25个方形视场进行观察，并对每一视场的着色强度进行分级，染色强度分为0级，1级（轻度），2级（中度），3级（高度）。

　　7.统计分析：全部实验结果采用SPSS 7.5软件包进行分析。

    结果

　　一、未干预组、洛非西定组、盐水组戒断症状的比较

　　未干预组的戒断症状总分平均为（156.0±9.6）分，洛非西定组的戒断症状总分平均为（84.3±4.6）分,盐水组的戒断症状总分平均为（0. 6±0.57）分，3组之间的差异有显著性（P<0.05）。其中未干预组之湿狗样颤抖、前爪震颤、咀嚼、叩齿、腹泻、躯体震颤及体积质量下降分值明显大于洛非西定组及盐水组(P<0.05)，洛非西定组上述分值大于盐水组(P<0.05)。未干预组跳跃、上睑下垂症状分值与洛非西定组的差异无显著性，但两组均高于盐水组(P<0.05)。

　　二、未干预组、洛非西定组、盐水组c-fos mRNA原位杂交结果

　　c-fos mRNA原位杂交染色强度结果为未干预组大于洛非西定组，洛非西定组大于盐水组。三组之间的差异有显著性(P<0.01)。表1。

表1　未干预组、洛非西定组、盐水组大鼠

组别	鼠数（只）	染色强度
		0级	1级	2级	3级
未干预	9	0	0	6	12
洛非西定	9	0	3	14	1
盐　水	9	14	4	0	0

注：经q检验，未干预组与盐水组比较，洛非西定与未干预组和盐水组比较， P均<0.01

    讨论

　　洛非西定是α2-肾上腺素能受体激动剂可乐定的同类物，由于其副作用明显低于可乐定（尤其是低血压反应），现已成为广泛应用的非替代脱毒治疗药物。洛非西定原作为抗高血压药使用，因有研究认为阿片类戒断症状是由肾上腺素能通路所介导的，而洛非西定能减轻因肾上腺素能作用而引起的症状如流眼泪、流鼻涕、出汗、腹泻、寒战等，因此用于阿片类药物依赖的脱毒治疗。但对其治疗的分子生物学机理不明。我们采用5 d腹腔内注射给药法建立大鼠吗啡依赖模型，结果显示经洛非西定干预后，湿狗样颤抖、前爪震颤、咀嚼、叩齿、腹泻、躯体震颤及体积质量下降等明显低于未干预组，跳跃和前爪震颤与未干预组的差异无显著性。这提示洛非西定对阿片类药物的戒断症状有肯定的治疗作用，与文献中可乐定的研究结果相似［8］。

　　真核基因 c-fos的蛋白产物与细胞的生长、分化及功能的调节密切相关［9］。虽然c-fos的功能尚不很清楚，但其作为信号转导系统中的“核内第3信使”，通过改变基因的表达，将细胞外刺激所致的细胞内短时信号与长期反应结合起来［10］。本结果显示，洛非西定组的c-fos mRNA表达活性高于盐水组，但低于未干预组。这提示洛非西定能抑制吗啡依赖大鼠蓝斑核c-fos mRNA的表达，从而使蛋白质的表达发生改变，导致神经递质的合成产生变化，从而对戒断症状起到控制作用。

    参考文献:

    1 Cox S, Alcorn R. Lofexidine and opioid withdrawal. Lancet,1995, 345:1385-1386.

    2 Maldonado R, Koob GF. Destruction of the locus coeruleus decreases physical sign of opiate withdrwal. Brain Res,1993,605:128-138.

    3 Maldonado R, Dauge V,Callebert J, et al. Comparison of selective and complete inhibitors of enkephalin-degrading enzymes on morphine withdrawal syndrome. Eur J Pharmacol,1989,165:199-207.

    4 Washton AM, Resnick RG, Geyer G. Opiate withdrawal using lofexidine:a clonidine analogue with fewer side effects. J Clin Psychiatry, 1983,44:335-337.

    5 Blasig J, Herz A, einhold K, Zieglgansberger S. Development of physical dependence on morphine in respect to time and dosage and quantification of the precipitated withdrawal syndrome in rats. Psychopharmacologia(Berl.),1973,33:19-38.

    6 Aghajanian GK, Cedarbaum JM, Wang RY. Evidence for norepinephrine-mediated collateral inhibition of locus coeruleus neurons. Brain Res, 1977,136:570-577.

    7 蔡文琴, 王伯云，主编. 实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术. 成都：四川科学技术出版社,1994.180-191.

    8 Aghajanian GK. Tolerance of locus coeruleus neurones to morphine and suppression of withdrawal response by clonidine. Nature,1978,276:186-188.

    9 Sonnenberg JI,Macgregor-Leon PF, Curran T, Morgan JI. Dynamic alterations occur in the levels and composition of transcription factor AP-1 complexes after seizure. Neuron, 1989,3: 359-365.

    10 Sagar SM, Sharp FR, Curran T. Expression of c-fos protein in brain: metabolic mapping at the cellularlevel. Science,1988,240:1328-1331.