【摘要】通过对海洛因吸食者毛发和空白添加标准品毛发的碱消解、酸消解、甲醇超声提取、甲醇5mol/L HCl超声提取、甲醇-三氟乙酸超声提取5种毛发中毒品及其代谢物的释放方法考察，确立了甲醇超声提取-液液萃取-气相色谱/质谱-选择离子检测的方法。本方法可最大程度地抑制海洛因的中间代谢物6-单乙酰吗啡的水解，其水解率仅为2.63%，极大地提高了海洛因滥用的毛发证据作用。利用本方法对添加6-单乙酰吗啡的毛发进行萃取和检测，6-单乙酰吗啡的回收率为52.6%，相对标准偏差RSD为4.6% ；对添加不同浓度的吗啡、可待因、6-单乙酰吗啡3种毒品的毛发进行萃取和检测，其线性良好(r>0.99)，相对标准偏差均小于15%。此外，考察了甲醇消解的影响因素，吸毒者毛发中的毒品释放效果随毛发的细碎程度和超声时间延长而提高。

　　【关键词】  毛发，毒品释放，鸦片类毒品， 气相色谱质谱选择性离子检测

　　1 引言

　　近年来，毛发分析已在诸多领域得到较广泛的应用，因为其具有尿液、血液等生物体液分析无法比拟的优越性：长时间的检测窗口；可靠的分析结果和全面的毒品滥用信息；检材易于获取、易于保存、易于重复取样等，所以毛发检材的应用受到关注。其在药物滥用鉴定中的作用也已被确证和公认[1]。

　　由于毒品及其代谢物的极性或脂溶性不同，血液中的毒品及其代谢物扩散进入毛囊并融入毛发的能力也不同。一般脂溶性强(极性小)的组分进入毛发的能力强，如鸦片类毒品中的海洛因和6-单乙酰吗啡(均含酯结构)；但血液中的这些成分很容易水解为吗啡。因此，血液中这些酯类成分的含量很低，且随着吸食时间的延长，浓度越来越低。最后可能只能检测到最终的代谢物吗啡，而检测不到原体或中间代谢物。由于吗啡也可由可待因代谢或由吸食吗啡产生，因此在生物检材中只检出吗啡，并不能证明是滥用了海洛因，有可能是由于服用了含有可待因或吗啡的药物导致，这样就使检测结果的证据力明显降低。为了提高海洛因滥用的证据力，6-单乙酰吗啡的检出是非常重要的。由于不同组分进入毛发的能力不同，使得海洛因代谢物在血液中的分布与在毛发中的分布不同[2]。血液中的成分以吗啡为主，而毛发中的成分以6-单乙酰吗啡为主[3]，因此毛发是证明滥用海洛因的最佳检材。

　　但是毛发是一个复杂组织，毒品进入毛发后，包埋在毛发的角蛋白中，首先需将其释放，呈游离状态才能进行提取和检测。又由于6-单乙酰吗啡很容易水解为吗啡，毛发的前处理过程不合适，会使得毛发中的6-单乙酰吗啡在此过程中转变为吗啡，从而使6-单乙酰吗啡的证据受到破坏。毛发中鸦片类毒品的的消解方法很多，有碱消解[4]、酸消解[5～8]、酶消解[9，10]和甲醇超声法[11～13]等。Rothe等[14]考察了10种溶剂直接消解提取毛发中鸦片类药物的效率，醇类的提取效果较好，其中甲醇最好。本研究通过对海洛因吸食者毛发和空白添加标准品毛发的碱消解、酸消解、甲醇超声提取、甲醇5mol/L HCl超声提取、甲醇-三氟乙酸超声提取5种毛发中毒品及其代谢物的释放方法考察，确立了甲醇超声提取-液液萃取-气相色谱/质谱-选择离子检测的方法为稳定、有效的海洛因滥用者毛发中毒品及其代谢物的释放与检测方法。本方法操作简单，重复性好。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　7890A气相色谱仪，配有5975C质谱检测器(安捷伦公司)；色谱柱为键合DB-5柱(30m×0.25mm，0.25 μm)；进样口温度250 ℃，柱箱起始温度150 ℃，保持1min，然后以20 ℃/min升至250 ℃，保持2.5min，再以30 ℃/min升至285 ℃，保持3min；氦气为载气，流速1.0mL/min，不分流。质谱检测器温度230 ℃，电子轰击离子源(EI)，电离能70 eV。SIM测试中，定性监测离子为：乙基吗啡m/z-296和409；6-单乙酰吗啡m/z-364和423；吗啡为m/z-69、364和477；可待因为m/z-395和282。定量监测离子为：乙基吗啡m/z-296；6-单乙酰吗啡m/z-423；吗啡m/z-364；可待因m/z-395。

　　吗啡盐酸盐、可待因盐酸盐、6-单乙酰吗啡盐酸盐购于公安部物证鉴定中心， 用甲醇溶解并配制成以游离碱计算的1.0 g/L的标准品储备液，置于–20 ℃冷冻室中保存。不同浓度的工作液均由储备液稀释而成；N-甲基-双三氟乙酰胺(MBTFA)购于Acros Organics公司；三氟乙酸购于国药集团化学试剂北京有限公司；0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH 9)；实验中所用试剂均为分析纯；实验用水为纯净水。

　　2.2 毛发检材的预处理及制备

　　空白样品取自没有吸毒经历的24岁男子；吸毒者毛发是取自禁毒机构提供的39岁有2年海洛因吸毒史的男子。毛发中海洛因代谢物的释放与分析方法研究 依次用1%洗涤剂、蒸馏水超声振荡待检毛发10min，自然晾干，密封待检。准确称取清洗干燥后的空白和吸毒者毛发20mg数份，备用。

　　2.3 毛发检材的消解及提取

　　分别向空白毛发中加入6-单乙酰吗啡标准品和内标(乙基吗啡)0.1 μg，混合均匀，制成添加6-单乙酰吗啡的毛发样品。分别采用5种方法：碱消解、酸消解、甲醇超声、甲醇5mol/L HCl(20∶1， V/V)超声消解和甲醇-三氟乙酸(8.5∶1.5，V/V)超声进行消解，调pH=9后，加入6mL氯仿、异丙醇、正庚烷(50∶17∶33，V/V)提取溶剂[15]，超声10min，离心10min，取下清液，空气流下吹干，用80 μL乙酸乙酯定容，然后加入20 μLmBTFA在60 ℃烘箱中加热30min进行衍生化，冷却后直接抽取1 μL进行GC/MS-SIM检测。

　　(1)碱消解方法 向检材中加入1mL 1mol/L NaOH，置于70 ℃水浴中加热30min，然后将消解液转移至15mL塑料离心试管中，加200 μL 5mol/L HCl， 1mL pH 9的磷酸盐缓冲液后提取检测；(2)酸消解方法 向检材中加入1mL 0.1mol/L HCl，45 ℃水浴过夜 (12 h)，然后将消解液转移至15mL离心试管中，加100 μL 1mol/L NaOH调pH后加入1mL pH 9的磷酸盐缓冲液后提取检测；(3)甲醇消解方法 向检材中加入1mL甲醇，60 ℃下超声振荡2 h，然后将甲醇液转移至15mL离心试管中，加入1mL pH 9的磷酸盐缓冲液后提取检测；(4)甲醇5mol/L HCl(20∶1，V/V)消解方法 向检材中加入1mL甲醇和0.05mL 5mol/L HCl，50 ℃下超声振荡2 h，然后将提取液转移至15mL离心试管中，用1mol/L NaOH 调至中性，加入1mL pH 9的磷酸盐缓冲液后提取检测；(5)甲醇-三氟乙酸(8.5∶1.5，V/V)消解方法 向检材中加入850 μL甲醇和150 μL三氟乙酸，放置12 h后， 50℃下超声振荡2 h，然后将提取液转移至15mL离心试管中，用1mol/L NaOH 调至中性，加入1mL pH 9的磷酸盐缓冲液后提取检测。空白毛发和真实吸毒者毛发预处理过程同上。

　　3 结果与讨论

　　3.1 消解条件对6-单乙酰吗啡水解的影响

　　考察了碱消解、酸消解、甲醇超声提取、甲醇5mol/L HCl超声提取、甲醇-三氟乙酸超声提取5种消解方法，在20mg空白毛发中添加6-单乙酰吗啡和内标(乙基吗啡)，均为0.1 μg ，经消解后提取、衍生化和检测，其中检出的吗啡为6-单乙酰吗啡水解生成。计算吗啡与6-单乙酰吗啡的峰面积比，通过标准品比对计算它们的含量，并计算6-单乙酰吗啡的水解率。碱消解、酸消解和甲醇5mol/L HCl消解均未检出6-单乙酰吗啡，即6-单乙酰吗啡的水解率为100%。甲醇-三氟乙酸消解检出微量6-单乙酰吗啡，其水解率为71.79%。甲醇消解检出更多的6-单乙酰吗啡，其水解率为2.63%。

　　图1 海洛因吸毒者毛发不同消解条件检测结果

　　A: 碱消解(Alkaline digestion)； B: 酸消解(Acid digestion)； C: 甲醇消解(Methanol extraction)；甲醇(Methanol)5mol/L HCl extraction； E: 甲醇-三氟乙酸(Methanoltrifluoroacetic acid(TFA) extraction).: 吗啡(Morphine)； : 可待因(Codeine)； : 6-单乙酰吗啡(6Acetylorphine).

　　海洛因吸毒者毛发的检测结果如图1所示。其结果与标准添加6-单乙酰吗啡的结果基本一致。碱消解、酸消解和甲醇5mol/L HCl消解均只检出可待因和吗啡，未检出6-单乙酰吗啡。甲醇-三氟乙酸消解检出了吗啡，并检出了6-单乙酰吗啡，但检出量极小。甲醇消解检出吗啡、可待因，以及最大量的6-单乙酰吗啡，并且重复性很好。但在该种条件下，吗啡的检出量低。而在其它消解条件下，尤其是碱性消解条件下， 吗啡的检出量最高。因此， 可以根据检测的对象不同选择合适的消解方法。

　　3.2 空白毛发中添加3种鸦片类毒品的分析

　　取空白毛发20mg，分别加入吗啡、6-单乙酰吗啡、可待因标准品溶液，制成浓度为0.5，2.5，5，25和50 μg/L的检材，分别加入100 ng/L 内标乙基吗啡标准溶液，按照甲醇超声处理过程进行提取和检测。表1 为3种组分的线性方程和LOD与LOQ；表2为0.5，5和50 μg/L浓度下的重复性及回收率。

　　乙基吗啡TFA(Ethylmorphine， trifluoroacetic aicd， TFA)；2. 吗啡2TFA(Morphine2TFA)；3. 可待因TFA(CodeineTFA)；4. 6-单乙酰吗啡TFA(6AcetylmorphineTFA).

    表1 空白毛发添加鸦片类毒品线性方程与LOD、LOQ

　　CodeineTFAy=0.2256x-0.02810.99990.5～500.070.5 y: 待测物峰面积与内标面积比的平均值(Average of peak ratio of analyte to intenal standard)； x: 毛发中待测物的浓度(Concentration of analyte in hair， μg/g)。

    表2 空白毛发添加鸦片类毒品的重复性、相对回收率

    由表2可以看出，可待因的回收率比较稳定，6-单乙酰吗啡的回收率偏低，这是因为在消解和提取过程中， 6-单乙酰吗啡会产生水解生成吗啡，并导致吗啡的回收率偏高。

　　3.3 甲醇消解条件的优化

　　3.3.1 毛发细碎程度的影响 实验证明，甲醇超声提取毛发中的6-单乙酰吗啡可最大程度地得到保留，而在此条件下提取，毛发细碎程度直接影响毛发释放毒品的效率。采用2.5mm镍镉合金钢珠与毛发一起漩涡研磨毛发，破坏毛发纤维，使毛发表面积增大，以提高释放效果。表3为剪碎后的吸毒者毛发(长约1～3mm)直接甲醇消解，和经过与80粒镍镉合金钢珠涡旋研磨5min之后甲醇消解，并进行液液提取、衍生化、GC/MSSIM检测后的结果比较。

　　由表3可见，毛发经钢珠研磨后，提取效率明显提高，检出量和重复性都明显改善。毛发细碎程度越大，与消解溶剂接触的表面积越大，甲醇消解后待测物提取率越高、稳定性也越好。

　　3.3.2 超声时间的影响 超声时间也是影响毛发中毒品提取率的重要因素。图4为经钢珠研磨后的吸毒者毛发在甲醇消解超声1， 2， 3， 4和5 h的比较结果。

　　由图4可见，超声时间增加使提取效率增加，但超声时间超过3 h之后效率提高不太明显，并会影响整个实验效率，所以采用3 h超声提取。表3 海洛因吸毒者毛发细碎程度的效果考察。

　　3.3.3 隔夜放置对分析结果的影响 文献[11]采用提取液浸泡毛发隔夜后，再超声萃取会增加提取率。本实验比较了甲醇超声3 h和甲醇浸泡过夜(约12 h)后再超声3 h的提取效果，提取率略有提高(见图4)。

　　3.4 小结

　　本研究确定了甲醇超声提取为灵敏、稳定、便捷的毛发中海洛因毒品的释放和提取方式。此方式可最大程度地抑制毛发中海洛因的代谢物6-单乙酰吗啡的水解，提高毛发的海洛因滥用证据力。甲醇超声释放虽然时间长，但是在后续的液液提取过程中不需要调节pH，不会造成6-单乙酰吗啡的水解，操作简便，重复性好，而且毛发细碎程度越高，超声时间越长，提取效果越好。将该方法用于海洛因滥用者的毛发检验，证明方法简单、准确、可靠。

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