大鼠局灶性脑缺血模型是缺血性脑血管病研究中应用最广的动物模型。它的制作需要在动物处于麻醉状态下通过外科手术完成。早先的观察发现,麻醉剂影响局灶性脑缺血的结局. 在自主呼吸的动物,戊巴比妥腹腔麻醉是目前制作局灶性脑缺血模型中最常用的麻醉方法之一[1-2]。氯胺酮为一短效麻醉剂,动物从氯胺酮麻醉状态的快速苏醒有利于早期观察脑损伤的神经病学症状,这是其明显优于现在常用的戊巴比妥之处[3]. 但评价氯胺酮麻醉对局灶性脑缺血损伤的影响研究极少,而且所获结果并不一致, 为此我们对氯胺酮麻醉下大鼠局灶性脑缺血后的神经病学和组织学结果进行了初步的探讨。
1 材料和方法
1.1 材料
雄性SD大鼠30只(体质量250~320 g)由西安交通大学医学院实验动物中心提供. 戊巴比妥和甲苯胺蓝购自美国Sigma公司;盐酸氯胺酮为上海第一生化制药厂产品;TTC为中国医药(集团)上海化学试剂公司生产;扫描仪(Scanjet 4470C, HewlettPackard, USA)和图像分析仪(Q550CW, Leica,Germany)由西安交通大学医学院第二附属医院病理科提供。
1.2 方法
雄性SD大鼠30只随机分为两组,每组15只,分别以戊巴比妥40 mg/kg或氯胺酮60 mg/kg腹腔麻醉[4]. 待翻正反射消失后,通过腔内线栓永久性阻塞大鼠大脑中动脉引发脑缺血. 大鼠大脑中动脉阻塞(Middle cerebral artery occlusion, MCAO)4 h,参照改良的Bedersons评分方法进行神经功能缺陷评分[5]. MCAO 24 h时,每组选取5只大鼠,经心灌注生理盐水100 mL,取脑,从头端至尾端连续切取8张2 mm厚的脑片,以20 g/L的TTC进行染色. 对TTC染色的脑片拍照扫描,采用参考文献[6]的方法确定梗塞体积,梗塞体积以梗塞部分占缺血同侧半球体积的百分比表示. MCAO 3 d时,每组取4只大鼠,采用相应的麻醉剂进行麻醉,40 g/L的多聚甲醛灌注固定. 取前囟前0.2 mm到前囟后1.2 mm之间的组织行冰冻切片,片厚20 μm. 为了检测半暗带内的存活神经元,每只脑取间隔200 μm的4张切片进行甲苯胺蓝染色(显示神经元为淡蓝色)[7]. 在甲苯胺蓝染色的切片上,按照文献[8]的方法通过图像分析仪对半暗带内的神经元进行定量。
统计学处理:动物死亡率的比较采用χ2检验. 其余资料采用SPSS for windows 10.0软件进行分析,组间比较采用t检验. 结果以x±s表示,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 神经病学评分和死亡率戊巴比妥组大鼠术中和MCAO 4 h内死亡4只,氯胺酮组死亡2只. MCAO 4 h时,戊巴比妥组(n=11)和氯胺酮组(n=13)的神经病学评分分别为1.5±1.0和1.4±0.7,两组间无显着性差异(P>0.05). 缺血后3 d死亡率在戊巴比妥组和氯胺酮组间无显着性差异(42% vs 33%,P>0.05)。
2.2 梗塞体积在TTC染色的脑片上,正常脑组织呈红色,而梗塞组织呈白色,但白质束包括胼胝体也呈白色. 缺血24 h,TTC染色检测梗塞体积结果显示,戊巴比妥组(n=5)和氯胺酮组(n=5)的梗塞体积分别为(37.8±5.0)%和(28.1±4.1)%(P<0.05)。
2.3 甲苯胺蓝染色对侧非缺血半球存在大量的神经元. 而在梗塞区仅见一些缺乏神经元形态特征的微弱染色. 在半暗带内,一些甲苯胺蓝染色的细胞表现神经元的形态特征. 神经元密度定量分析显示,氯胺酮组(n=4)半暗带内神经元密度明显高于戊巴比妥组(n=4)[(836±15)个/mm2 vs (740±24)个/mm2, P<0.05,图1]。
3 讨论
已有的研究关于氯胺酮麻醉对脑缺血模型的影响并没有得到明确的结论. 目前关于氯胺酮麻醉对大鼠局灶性脑缺血模型结局影响的研究很少. 我们的实验发现,虽然氯胺酮麻醉和戊巴比妥麻醉大鼠的缺血后神经病学评分和死亡率相似,但与戊巴比妥相比,氯胺酮麻醉下制作的模型产生较小的脑梗塞体积和较高的半暗带内神经元密度. 就脑梗塞体积和神经病学评分之间的相关性而言,在人和动物的中风模型中都获得了矛盾的结果[9]. 我们的结果并不支持梗塞体积和神经病学评分之间的相关性. 除了作为麻醉剂之外,氯胺酮也是N甲基D天门冬氨酸受体拮抗剂,它能通过部分恢复能量储备和氨基酸含量、降低钙内流和维持脑组织的镁水平产生神经保护[10]. 尽管如此,是否氯胺酮具有神经保护作用仍有争议,我们的结果表明氯胺酮具有神经保护作用. 这也意味着在氯胺酮麻醉下评价一些药物或方法对局灶性脑缺血的神经保护作用时,应考虑麻醉剂的神经保护作用,以免过高估计药物的作用[9]。
在本实验的设计方面主要基于以下原因:①最根本的问题是研究氯胺酮麻醉对大鼠脑缺血模型结局的影响. 我们采用了它的麻醉剂量,并以最常用的麻醉剂戊巴比妥作为对照,更能客观的反映氯胺酮的影响作用;②为了客观评价大鼠大脑中动脉阻塞后的脑功能损害和梗塞体积,我们在MCAO 4 h和24 h进行了神经病学评分和梗塞体积测量[9];③为了较准确评价戊巴比妥和氯胺酮麻醉对大鼠脑缺血损伤影响的差异,我们将甲苯胺蓝染色的时间确定在组织学评估所要求的最短观察期3 d[11]. 这种设计保证了本研究结果的客观性和可靠性。
【参考文献】
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