【摘要】目的：研究氟西汀是否能治疗酒依赖和减缓酒依赖对大脑的损伤。方法：将84只大鼠随机分入空白对照组、酒依赖组和氟西汀组。在实验第8w末和第14w末分别取材，进行脑干5-羟色胺（5-HT）免疫组化染色和各脑区神经元计数，并测定大鼠血清皮质醇和神经元特异性烯醇化酶（NSE）的浓度。结果：与酒依赖组相比，氟西汀组的戒断症状很轻。酒依赖组脑神经元缺失较多，血清皮质醇和NSE明显升高；而氟西汀组的脑神经元缺失较少，在右侧海马区的神经元缺失更少（P=0.002）。血清皮质醇和NSE浓度与大鼠脑神经元数呈负相关；5-HT染色强度与血清皮质醇(r=-0.281)和NSE(r=-0.340)浓度呈负相关，与右侧顶叶(r= 0.271)和双侧海马(r=0.423,0.416)神经元数呈正相关。结论：氟西汀不仅可以治疗酒依赖时的戒断症状，还可以减缓由酒依赖和酒戒断所致的大脑损伤，尤其是更能减缓对海马的损伤。

    【关键词】 酒依赖； 氟西汀；  皮质醇； 神经元特异性烯醇化酶； 海马

    酒依赖形成的机制虽然目前仍不清楚，但5-HT功能低下被认为在酒依赖形成机制中起重要作用[1]，选择性5-HT再摄取抑制剂在酒依赖治疗中也能取得良好效果，如氟西汀可以减少饮酒量、防止复发，尤其对合并抑郁、焦虑等症状的酒依赖者效果更好[2]。本研究在酒依赖大鼠动物模型基础上，应用氟西汀提高脑内5-HT活性，观察其对酒依赖大鼠大脑损伤、血清皮质醇、NSE和戒断症状等指标的影响，以探讨氟西汀对治疗酒依赖和减缓酒依赖引起大脑损伤的作用及其可能的机制。

对象和方法

一、实验材料

    1.实验动物  健康雄性Wistar大鼠84只（其中10只在实验过程中意外死亡），体重190g ±10g，购自中国农业科学院哈尔滨市兽医研究所实验动物中心，实验动物合格证书编号P00102008。

    2.实验药品  氟西汀，礼来苏州制药有限公司生产，批号：009041；食用酒精，黑龙江肇东华润金玉实业有限公司提供，批号：200105080。

    3.实验试剂  皮质醇检测药盒 由中美合资天津德普（DPC）生物技术和医学产品有限公司提供；NSE检测药盒 由瑞士罗氏公司提供；5-羟色胺（BA0121）多克隆抗体、即用型SABC免疫组化染色试剂盒（SA1022）和DAB显色试剂盒 由武汉博士德生物工程有限公司提供。

    4.实验仪器  DDL-5型低温离心机，上海安亭科学仪器厂；超低温冰箱，丹麦HETO公司；GC-20型γ-计数仪，中国科大中佳光电仪器分公司；Elecsys1010型电化学发光仪，瑞士罗氏公司。

二、实验方法

    1.酒依赖大鼠动物模型的建立  以食用酒精和生理盐水勾兑的饮料灌胃，灌胃量为10ml·kg-1·d-1，第1w、2w、3w酒精浓度分别为5%、10%、20%，第4w以后酒精浓度为35%（酒精摄入量为3.5g·kg-1·d-1），时程为8w。在戒断后第36h密切观察戒断症状2h，按柳田知司评分法 [3]评定戒断症状和模型效果。

    2.实验分组和取材时间  实验总时程14w，分第一阶段（第1w~8w）和第二阶段（第9w~14w）。分三大组：① 空白对照组：22只大鼠。在实验中每日以生理盐水灌胃，灌胃量为10ml·kg-1·d-1。本组又分两个亚组，在第一阶段末处死并取材的10只大鼠称之为空白对照组1；在第二阶段末处死并取材的12只大鼠称之为空白对照组2。② 酒依赖组：31只大鼠。第一阶段按照以上酒依赖大鼠动物模型喂养，在第一阶段末（戒酒后36h）抽取10只大鼠处死并取材，称之为酒依赖组1。第二阶段将剩余的21只大鼠再分成酒依赖非治疗组10只和酒依赖治疗组11只两个亚组。酒依赖非治疗组戒酒并以生理盐水灌胃，灌胃量同空白对照组；酒依赖治疗组戒酒并每天给予氟西汀（现配，浓度为2kg/l）5mg/kg灌胃；在第二阶段末处死这两个亚组大鼠并取材。③ 氟西汀组：21只大鼠。第一阶段按照以上酒依赖大鼠动物模型喂养，同时每天再给予氟西汀（现配，浓度：2kg/l）5mg /kg灌胃，在第一阶段末（戒酒后36h）抽取10只大鼠处死并取材，称之为氟西汀组1；第二阶段起戒酒，继续给予氟西汀灌胃，在第二阶段末处死其余11只大鼠并取材，称之为氟西汀组2。

    3.取材方法  20%乌拉坦1.5g～2g/kg腹腔注射将大鼠麻醉，开胸，迅速从右心室采血3ml，然后左心插管至主动脉，剪开右心耳，先以预冷的肝素化生理盐水50 ml冲洗， 再以4%多聚甲醛(pH 7.4) 100ml灌注，固定1 h，断头后完整取脑，于前囟处以美兰标记，置于上述灌注液内，外固定7 d。所采全血立即低温离心，取血清于超低温冰箱（-78℃）内保存，整批检测。

    4.观察指标与测定方法 

    (1) 病理观察  ①脑叶：常规系列脱水，石蜡包埋，全脑冠状切片，分别于前囟前3mm（额叶）、前囟后3.8mm（颞叶、顶叶）和8mm（枕叶）处收取15μm切片1张（尼氏染色），计数大脑各部位皮质内锥体层神经元数目，取3个高倍镜（10×40）视野下神经元计数的平均数（四舍五入）。②海马也以前囟后3.8 mm冠状切片为准，取5μm切片1张（HE常规染色），在显微镜下以显微计数尺计数海马CA1区1 mm长范围内细胞膜和核膜完整、核仁清楚的锥体细胞数目。③小脑：自蚓部做正中矢状切口，将小脑分为两半。于左侧小脑半球距离蚓部正中切面0.5mm处做旁矢状切口，切下的组织进行常规脱水，石蜡包埋，并以蚓部正中部位作为切面，收取30μm切片一张，尼氏染色，镜下观察，应用手动计数器，计数前上蚓部的全部浦肯野细胞数目。

    (2) 5-HT染色  脑干横切取正中部中缝核处5μm片，以双抗法进行5-HT免疫组化染色。显微镜观察，记录中缝核5-HT神经元阳性强度，其染色强度分级从弱到强依次为：（-）未着色，（+）黄色，（++）浅棕色，（+++）深棕色。

    (3) 皮质醇与NSE测定  血清皮质醇采用双抗放射免疫分析法测定；血清NSE采用电化学发光法测定。

    5.统计学处理  采用SPSS10.0统计软件，组间比较用独立t检验，左右大脑半球的比较用配对t检验，5-HT染色结果用多个独立样本的秩和检验，相关分析采用Pearson（连续变量）和Spearman（分类变量）相关分析，以P＜0.05为有统计学意义。

结  果

一、戒断症状评分与动物模型评价 

    戒断后各组大鼠戒断症状的评分酒依赖组（9.258±5.497）与空白对照组（0.659±2.049）相比P<0.0005，这表明酒依赖大鼠动物模型构建成功。戒断症状评分氟西汀组（6.857±4.960）与酒依赖组（9.258±5.497）相比t检验P=0.115。

二、5-HT免疫组化染色 

    其结果（见表1）表明空白对照组染色阳性强度最强，氟西汀组次之，酒依赖组最弱。经多个独立样本的秩和检验，χ2=19.944，df=6，渐进概率P=0.003。

三、酒对大脑的损伤 

    1.戒酒36h  各脑叶神经元损害程度，在空白对照组1神经元平均计数左额叶127.40±9.29，左顶叶127.30±13.71，左海马169.20±13.27，右额叶127.10±7.49，右顶叶125.70±12.26，右海马169.10±14.01；而在酒依赖组1神经元平均计数左额叶117.00±12.07，左顶叶116.40±6.79，左海马154.00±10.04，右额叶115.70±11.48，右顶叶110.10±9.77，右海马153.50±9.47；在这两组以上各相对的脑叶之间经t检验，P值分别为0.045，0.037，0.010，0.017，0.006，0.009，均小于0.05；而在这两组双侧各相对的颞叶和枕叶之间t检验P值均大于0.05。

    2.戒酒6w  各脑叶神经元损害程度，在空白对照组2神经元平均计数左顶叶134.08±16.45，左海马167.58±14.22，右额叶129.33±13.78，右顶叶132.42±14.02，右海马164.50±13.61；而在酒依赖非治疗组神经元平均计数左顶叶118.90±17.21，左海马154.70±9.59，右额叶112.40±23.38，右顶叶114.50±21.59，右海马149.80±6.76；在这两组以上各相对脑叶之间经t检验，P值分别为0.048，0.024，0.047，0.029，0.006，均小于0.05；而在这两组其他各相对脑叶之间t检验P值均大于0.05。

    3.左右脑损伤比较  酒依赖组1大脑左半球神经元平均计数顶叶122.90±16.73，海马157.16±13.13；而大脑右半球神经元平均计数顶叶118.16±19.79，海马153.65±11.83；经配对t检验，左右顶叶之间和左右海马之间的P值分别为0.010、0.034；而在这组其他脑叶左右之间配对t检验P值均大于0.05。

四、氟西汀减缓大脑损伤作用 

    酒依赖非治疗组神经元平均计数左额叶116.40±19.07，右额叶112.40±23.38，右海马149.80±6.76；而在氟西汀组2神经元平均计数左额叶131.45±10.24，右额叶134.27±12.27，右海马161.64±8.13；在这两组以上各相对的脑叶之间经t检验，P值分别为0.034，0.014，0.002，均小于0.05；而在这两组其他各相对的脑叶之间t检验P值均大于0.05。酒依赖治疗组神经元平均计数与酒依赖非治疗组之间各相对脑叶神经元平均计数比较P值均大于0.05。

五、氟西汀对小脑作用

     小脑上蚓部的浦肯野细胞数在空白对照组1、酒依赖组1和氟西汀组1三组之间均无统计学上差异。

六、氟西汀对酒依赖大鼠血清皮质醇和血清NSE的抑制作用 

    1. 戒酒后36h  空白对照组1血清皮质醇为0.443±0.180 ug/dl，NSE浓度为0.130±0.070 ug/l；而酒依赖组1血清皮质醇为0.662±0.183 ug/dl，NSE浓度为0.250±0.112ug/l；两组相比，P值分别为0.015、0.010。氟西汀组1血清皮质醇为0.514±0.084 ug/dl，NSE浓度为0.164±0.053 ug/l，与酒依赖组1比较P值分别为0.032、0.041，而与空白对照组1比较P值分别为0.273和0.245。

    2 . 戒酒后6w  血清皮质醇酒依赖非治疗组（0.530±0. 070ug/dl）与酒依赖组1（0.662±0.183ug/dl）相比，P值为0.046；而NSE酒依赖非治疗组（0.189±0.033ug/dl）与酒依赖组1（0.250±0.112ug/dl）比较P值为0.116。血清皮质醇氟西汀组2（0.460±0.072ug/dl）与酒依赖非治疗组（0.530±0.070 ug/dl）比较P值为0.038；但血清NSE这两组相比P值为0.369。血清皮质醇和NSE在氟西汀组2与空白对照组2之间相比的P值分别为0.559和0.410。这两项指标在酒依赖治疗组与酒依赖非治疗组之间相比的P值分别为0.154和0.669。但血清皮质醇酒依赖非治疗组（0.530±0.070ug/dl）与空白对照组2（0.439±0.094ug/dl）相比P值为0.021；血清NSE酒依赖非治疗组（0.189±0.033ug/dl）与空白对照组2（0.133 ±0.057ug/dl）相比P值为0.012。

七、相关分析 

    将血清皮质醇、NSE浓度和各脑叶神经元计数进行的连续变量相关分析，见表2。将5-HT染色强度与某些相关指标进行的分类变量相关分析，见表3。

讨  论

    我们的研究表明，酒依赖组大鼠的脑损害以额叶、顶叶和海马最为明显，而且大脑左右半球的损伤并不对称，右侧半球损害要重于左侧半球，尤其以右顶叶和右海马损害更重。这与我们以前的研究[4，5]有相同之处。我们发现氟西汀组大鼠戒酒后产生的戒断症状比酒依赖组明显少而轻，我们还发现氟西汀组额叶和海马神经元缺失的数量明显比酒依赖组的少，这些都表明氟西汀不仅具有治疗酒依赖的作用，同时也具有减缓酒依赖及酒戒断所致大脑损伤的作用，尤其是减缓对海马的损伤作用。

    血清NSE是中枢神经特异的蛋白质，是脑损伤的特异性标志物之一，其浓度测定对急性脑血管病，癫痫持续状态，Alzheimer's病、血管性痴呆、急性脑外伤等多种中枢神经系统疾病的脑损伤程度和预后判断具有临床实用价值，但目前血清NSE与饮酒所致脑损伤的关系尚未有报道。本研究发现酒依赖组血清NSE浓度明显高于空白对照组，而氟西汀组血清NSE升高受到了明显抑制，酒依赖治疗组血清NSE的升高受到的抑制并不明显。此外，血清NSE浓度与血清皮质醇浓度呈正相关，与双侧额叶、右顶叶及右海马神经元数呈负相关，这说明血清NSE浓度升高可能是来自于酒精所致的大脑损伤，皮质醇过度增高也可能与大脑损伤有关。

    海马神经元对酒精较为敏感，饮酒会造成海马损伤，导致海马体积缩小和功能异常[6]。除了酒精直接损伤外，机体重要的应激因子皮质醇也能导致海马损伤，因为海马是中枢神经系统中富含皮质醇受体最多的脑区[7]。饮酒可刺激下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴功能，促进下丘脑释放促肾上腺皮质激素释放激素和垂体后叶加压素，导致血浆内促肾上腺皮质激素和皮质醇浓度升高。间断小量饮酒会使HPA轴产生对酒的缓慢、持久的耐受现象，长期大量饮酒就会使酒对HPA轴的刺激因耐受作用而减弱，甚至抑制对其它应激的反应，这种致敏和耐受现象反过来会促进和强化饮酒行为、使酒依赖加重[8]。长期饮酒及伴随的皮质醇过度升高就会造成海马损伤，影响学习、记忆和认知功能。正常情况下5-HT能刺激和加强HPA轴的功能，但在应激时却可以抑制HPA 轴的功能过度增强[9]，提高海马神经细胞摄取5-HT能力、易化5-HT神经传递功能可有效地阻止应激对海马的损伤，保护海马的功能[10]。我们的研究也发现，血皮质醇浓度与顶叶和海马的损伤呈显著正相关；5-HT染色强度与血清皮质醇、NSE浓度呈负相关，与双侧顶叶和海马损伤呈负相关；酒依赖及酒戒断时所致的皮质醇过度升高可被5-HT再摄取抑制剂氟西汀明显抑制。这些都表明了提高5-HT活性可以减缓酒精对大脑的损伤，并可拮抗皮质醇的神经毒性作用。由此我们可以推测，氟西汀对酒依赖的治疗作用和减缓酒依赖对大脑的损伤作用可能是与氟西汀能够提高5-HT活性、调节下丘脑-垂体-肾上腺轴活性、抑制酒精和酒戒断时所致的皮质醇过度分泌有关。

表1  各组大鼠5-HT染色结果频数表

表3  5-HT染色强度与血清皮质醇、NSE和各脑叶神经元数的分类变量相关分析

注：*P＜0.05， **P＜0.01