【摘要】目的：研究大麻CB2受体在人皮肤及皮肤恶性肿瘤的组织分布。方法：用兔抗人CB2受体抗体做免疫组化，检测人类皮肤及皮肤恶性肿瘤组织CB2受体表达分布情况。结果：CB2受体在人类皮肤及皮肤恶性肿瘤均有表达分布，且皮肤恶性肿瘤的CB2受体过度表达。结论：大麻素受体CB2的表达与皮肤恶性黑素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌关系密切。

　　【关键词】大麻素受体 皮肤 恶性肿瘤 免疫组化

　　大麻(marijuana，植物学名cannabissativa)，其主要活性成分是△9-四氢大麻酚(△9-THC)，既是毒品又是具有抑制细胞生长、抗炎症、抑制肿瘤生长等作用的治疗药。大麻素(CB)受体是指对大麻类物质如△9-THC有应答的受体，分两型CB1和CB2，它们均为G蛋白耦联受体。CB1受体包含473个氨基酸，该受体在进化中有着高度保守性和重要性，主要分布于神经系统。CB2受体包含360个氨基酸，其保守性不强，主要分布于外周免疫系统。近年来大麻素受体在神经系统以外的表达和功能研究，特别是在肿瘤方面的研究逐渐受到重视。大量研究表明，大麻素CB2受体的激活抑制皮肤肿瘤的生长[1]。我们采用抗CB2N末端抗体做免疫组化检测，研究CB2受体在人类正常皮肤及皮肤肿瘤的表达分布，可为今后CB2激动剂的抗皮肤肿瘤研究提供有用的实验资料。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料组织  来自我科门诊病例从2000～2007年期间活检标本（经100mL/L的甲醛固定和石蜡包埋，切片机切片3μm，其中人正常皮肤、黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌各20块标本）；一抗（1∶350兔抗人抗CB2抗体）购自AffinityBioReagents，ABR，USA；二抗（通用型山羊抗兔IgG抗体Fab段HRP多聚体）通用型SP系列检测试剂盒兔SPKit购自北京中山金桥生物技术有限公司；DAB显色试剂盒购自北京中山金桥生物技术有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 免疫组化  漂浮切片用ABC法染色[2]，切片以二甲苯进行脱蜡后270℃枸椽酸溶液进行抗原修复，以300mL/L双氧水室温孵育20min，以阻断内源性过氧化物酶。PBS冲洗3次，与一抗4℃过夜。次日，PBS冲洗3次，与二抗37℃下孵温30min，PBS冲洗3次后，棕黄色DAB显色试剂盒显色。每次实验均设立阴性对照一个，即在免疫组织化学染色过程中不加CB2受体一抗，其余步骤相同，阴性对照DAB不能使其显色。苏木素染色完成后将切片贴在玻片上，脱水、封片，在OLYMPUS2BHF型显微镜下观察。

　　1.2.2 图像分析  应用ImageProPlus彩色图像分析系统，每张切片选取5个有代表性的400倍视野，CB2受体阳性细胞为视野中着棕褐色的圆形或椭圆形区域，测量每个标本CB2受体阳性细胞面积及累积光密度IOD值的均值并记录。

　　1.2.3 统计学处理  实验数据采用SPSS11.0统计软件处理。免疫组化结果CB2受体阳性细胞面积及累积光密度IOD值均用x±s表示，根据资料性质应用方差分析方法对实验数据进行统计学分析。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 CB2受体在人正常皮肤表达的检测结果  在人类正常皮肤中CB2染色主要位于表皮层的角质层和基底细胞层(图1A)。表明本实验所用抗CB2抗体可特异性识别CB2。CB2受体在人皮肤恶性肿瘤中表达的检测结果发现在皮肤恶性肿瘤黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌的肿瘤细胞中均有CB2受体染色阳性细胞，且均有较强表达，在皮下组织中表达不明显(图1B～D)。

　　图1 CB2受体在人皮肤及皮肤恶性肿瘤的组织分布（×400）（略）

　　A：人正常皮肤；B：恶性黑素瘤；C：基底细胞癌；D：鳞状细胞癌.

　　2.2 CB2受体阳性细胞面积及累积光密度IOD值统计学分析  应用ImageProPlus彩色图像分析系统测定阳性细胞面积及累积光密度IOD值（表1），应用方差分析方法分析（表2），阳性细胞面积中，皮肤恶性肿瘤较正常皮肤均有统计学意义；其中恶性黑素瘤较正常皮肤、基底细胞癌及鳞癌组均有统计学意义；基底细胞癌和鳞癌比较无统计学意义。IOD趋势与阳性细胞面积一致。表明正常皮肤CB2受体表达强度明显小于皮肤恶性肿瘤，其中恶性黑素瘤表达最强，基底细胞癌和鳞癌间无统计学意义。

　　表1 CB2受体阳性细胞面积及累积光密度IOD值（略）

　　表2 CB2受体阳性细胞面积及累积光密度IOD值方差分析（略）

　　3 讨论

　　大麻其主要活性成分是△9-THC，既是毒品又是具有临床药理作用治疗药。20世纪90年代初，大麻素受体的2种亚型(CB1受体和CB2受体)被成功克隆，并且从猪脑中提取出内源性CB。大麻素对中枢神经系统、免疫系统、心血管系统、消化系统及生殖系统均有广泛作用，具有镇痛、消炎等作用，临床上用于治疗帕金森病、艾滋病、肿瘤等患者。既往的研究主要中于大麻受体在神经系统的作用，

　　自Pross等[3]发现CB2受体在脾脏、淋巴结和淋巴细胞的表达之后，大麻受体在神经系统以外的表达和功能研究，特别是在肿瘤方面的研究逐渐受到重视。迄今，CB受体及其配体的研究已经有了阶段性进展。大量研究表明，大麻素受体被活化后可抑制皮肤肿瘤的生长。

　　已有报道CB2受体在正常皮肤主要分布于上皮细胞、巨噬细胞、肥大细胞、感觉神经纤维、毛囊、汗腺等部位[4]，参与皮肤感觉传导、疼痛机制、皮肤免疫、皮肤肿瘤、细胞分化等重要的生理病理过程[5]。通过对神经胶质细胞瘤[6]、甲状腺上皮瘤[7]的研究，表明在体外大麻素选择性作用于肿瘤细胞。且大麻素受体调节细胞存活通路过程中对瘤细胞和非肿瘤细胞存在不同。MLlanosCasanova等研究证实CB2受体在人皮肤鳞癌和基底细胞癌等表达，并且证实在活体内大麻素可抑制皮肤肿瘤[1]。Blzquez等研究发现人类黑素瘤和黑素瘤细胞株均表达CB2受体[8]。且实验表明大麻素受体的激活可抑制肿瘤的生长、增生、血管形成和转移，促进肿瘤的凋亡。

　　我们应用免疫组化结合图像分析技术对正常皮肤标本及黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌3种皮肤恶性肿瘤进行检测，发现CB2受体在正常皮肤组织标本中出现较弱阳性染色，阳性细胞主要见于基底层，表明正常情况下基底细胞有CB2受体表达。而在皮肤恶性肿瘤中，无论阳性细胞面积还是阳性累计密度均高于正常皮肤，证实大麻素受体CB2的表达与皮肤恶性肿瘤恶性黑素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌关系密切。

　　【参考文献】

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　　[2] 崔永兴, 涂静宜, 李冬梅, 等. 不同修复方法对免疫组化染色结果的影响[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2006, 22(3): 390-391.

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　　[4] Stnder S, Schmelz M, Metze D, et al. Distribution of cannabinoid receptor 1 (CB1) and2 (CB2) on sensory nerve fibers and adnexal structures in human skin[J]. J Dermatol Sci, 2005, 38(3): 177-188.

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　　[6] Gmez Del Pulgar T, Ceballos ML, Guzmn M, et al. Cannabinoids protect astrocytes from ceramideinduced apoptosis through the phosphatidylinositol 3kinase/protein kinase B pathway[J]. J Biol Chem, 2002, 277(39): 36527-36533.

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　　[8] Blzquez C, Carracedo A, Barrado L, et al. Cannabinoid receptors as novel targets for the treatment of melanoma[J]. FASEB J, 2006, 20(14): 2633-2635.