【摘要】目的：通过研究内源性大麻素物质（anandamine，AEA），对体外培养的牛眼小梁细胞的增殖、黏附以及迁移功能的影响，探讨AEA降低眼压的机制。方法：对牛眼小梁细胞进行体外原代培养及传代培养，应用免疫组化的方法（NES，Ⅷ因子相关抗原染色）鉴定细胞，化学及透射电镜观察。对3代牛眼小梁细胞分别以含AEA10，1，0.1，0μmol/LDMEM(含100ml/L小牛血清)培养液进行干预，分别于24,2h,2h后用MTT法计数细胞，再利用计算机统计软件进行数据分析，观察其对牛眼小梁细胞的增殖、粘附及迁移功能的影响。结果：内源性大麻素，在一定浓度范围内，对体外培养的牛眼小梁细胞的增殖、粘附及迁移功能均有较为明显的抑制作用（P＜0.05）。结论：由此，可以了解到AEA可能是通过影响小梁细胞的增殖、粘附及迁移功能来改变房水流出途径的阻力，而降低眼内压。

　　【关键词】牛眼小梁细胞；内源性大麻素；纤维连接蛋白；原发性开角型青光眼

　　原发性开角型青光眼（primaryopenangleglaucoma，POAG）是全世界常见的致盲眼病之一，目前的治疗方案仍然存在争论。但为了控制患者的眼压，以求达到靶眼压，人们一直在找寻一种经济适用的药物来控制眼压水平。POAG的发生和小梁细胞的生物学功能的改变有着密不可分的关系。研究小梁细胞在药物作用下的增殖、粘附以及迁移功能的改变对研究POAG的发病机制和治疗方法都具有重要的临床意义。自从1971年Helper等发现吸食大麻素可以降低25%～30％的眼压后，人们对大麻素在抗青光眼方面的作用做了很多研究，如Kumar等［1］的研究曾提示，大麻素对小梁细胞的生物学功能有不同程度的影响。我们通过研究内源性大麻素物质（anandamine，AEA），N花生四氢酸氨基乙醇对体外培养的牛眼小梁细胞的增殖、粘附和迁移的影响，试图对大麻素的降眼压机制进行一些有益的探索。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料  取附近屠宰场现杀新鲜牛眼。牛眼符合下列条件：全部为小牛眼，牛龄小于24mo,以保证小梁细胞培养的成活率，剜取牛眼时如有眼球破裂及眼内炎症则全部废弃，以减少污染机会。将牛眼置于有冰袋的保温桶中，迅速运回实验室。DMEM高糖培养基购自Gibco公司。小牛血清购自杭州四季青公司。胰蛋白酶、EDTA和大麻素购自Sigma公司。纤维连结蛋白购自CHMICON公司。Transwell购自COSTAR公司。MTT试剂由西安交通大学提供。

　　图1 体外培养的牛眼小梁细胞原代至3代的形态（略）

　　A：为体外培养的原代细胞；B：为体外培养的1代细胞；C：为体外培养的2代细胞；D：为体外培养的3代细胞

　　1.2 方法  牛眼小梁细胞培养参考杨新光等［2］的方法并加以改进。小梁细胞游离组织块后，每周换液2次。待细胞长满瓶底后用1.25g/L的胰蛋白酶和0.2g/LEDTA消化传代。取第2代的小梁细胞接种于预置盖玻片的培养皿，待细胞贴壁2d后用0.01mol/LPBS液清洗3次，40g/L的多聚甲醛固定，行NSE、vimentin及ⅧR：Ag免疫组化染色。另取细胞铺片，用4℃预冷的20g/L戊二醛固定，交电镜室透射电镜标本制备。

　　1.2.1 测定AEA对牛眼小梁细胞增殖的影响  取三代牛眼小梁细胞接种于96孔培养板，接种密度约为3×104个/孔。分组加入含AEA10，1，0.1，0μmol/LDMEM(含100g/L小牛血清)培养液，至于37℃细胞培养箱中孵育24h后取出。用MTT法检测不同浓度AEA对牛眼小梁细胞增殖的影响。

　　1.2.2 测定AEA对牛眼小梁细胞粘附功能的影响  取三代牛眼小梁细胞接种于以10mg/Lfibronectin预先包被的96孔培养板，接种密度约为3×104个/孔。分组加入AEA10，1，0.1，0μmol/LDMEM无血清培养液，置于37℃细胞培养箱中孵养2h取出。用MTT法检测不同浓度AEA对牛眼小梁细胞黏附功能的影响。

　　1.2.3 测定AEA对牛眼小梁细胞迁移能力的影响  取三代牛眼小梁细胞制成不含血清的DMEM细胞悬液，置于24孔Transwell的上方小室内（1×108个/L），不同浓度组分别含有AEA10，1，0.1，0μmol/L。下方小室加入含fibronectin20mg/L的DMEM完全培养液。置于37℃细胞培养箱中孵养2h，取出。用MTT法检测不同浓度AEA对牛眼小梁细胞迁移能力的影响状况。

　　2 结果

　　培养细胞的形态学观察牛眼小梁细胞原代培养5～8d细胞由组织块向外生长，原代细胞形态差异较大，呈圆形，梭形，多角形。细胞轮廓清，折光性较强。细胞核圆，胞质颗粒多。传代接种细胞数为4×107个/L，24h左右贴壁。传至3代的小梁细胞有稳定的形态结构。细胞胞质丰富，颗粒较多，细胞可见胞突和分支。融合后细胞呈扁平上皮样，胞核呈卵圆形。由于原代牛眼小梁细胞对胰蛋白酶敏感，采用1.25g/L胰蛋白酶和0.2g/LEDTA消化细胞，并按1∶1对原代细胞传代。细胞生长良好的，第1代细胞可按1∶2或者1∶3向后传代。透射电镜见细胞胞质丰富，富含核糖体、线粒体和高尔基复合体，有较多空泡。核膜周围可见微丝。核膜双层，核周异染色质明显，核仁明显，可见双核仁。小梁细胞NSE染色阳性，vimentin染色阳性，ⅧR：Ag色阴性。证实了小梁细胞是神经外胚层神经嵴间充质来源。结果与吴琼等[3]相同。综上所述，从培养细胞的生长过程、形态学观察和免疫组化特性上证明，所培养的细胞即为小梁细胞(图1)。AEA对牛眼小梁细胞增殖功能的影响（表1）;AEA对牛眼小梁细胞粘附能力的影响结果（表2）;AEA对牛眼小梁细胞迁移能的影响结果（表3）。

　　3 讨论

　　POAG的发病机制目前还不是十分清楚。近年来，通过小梁细胞的体外培养，对小梁细胞的结构、功能、小梁细胞的代谢和药物对小梁细胞的功能的影响、小梁细胞外基质、细胞骨架、细胞膜受体等进行了广泛的研究，发现POAG患者的小梁网变性、硬化;小梁细胞增生或细胞数量减少;小梁细胞的微丝活动减弱,吞噬、清除异物能力下降;其细胞外基质成份在数量和质量上发生改变,细胞外基质物质沉积,这些改变都与衬覆在小梁柱表面的小梁细胞的形态和功能发生改变密切相关［4］。小梁细胞具有多种功能，如增殖，迁移、粘附、吞噬、分泌以及清除细胞外基质等作用［5］，任何一种小梁细胞功能的受损或异常都有可能导致房水流出阻力的增加。小梁细胞是维持房水外流通畅的重要因素之一，体内小梁细胞的增殖处于一个动态平衡之中，其过度的增殖或者增殖不足都有可能导致房水流出通道的通畅性发生改变，从而导致眼压的升高。现已证明，青光眼患者的小梁细胞较正常人为少［6］，这是一项重要的病理改变。本实验表明AEA对体外培养的牛眼小梁细胞的增殖有较为明显的抑制作用，这种抑制作用在AEA的一定浓度范围内表现为浓度依赖性。有研究表明，在房水中存在一些对小梁细胞具有化学趋化作用的物质［7］，进一步试验证明，这些化学引诱物的主要成分有TGFβ1、纤维连接蛋白（Fibronectin）［7］。近来一些研究证明，在青光眼患者的房水中，其TGFβ1、fibronectin的含量较正常人群为高［8］。有人推测，fibronectin可能与小梁细胞从小梁支架上的脱落、丢失有关［8］，而小梁细胞的脱落、丢失等异常改变则可能会影响房水流出通道的通畅性［9］。本试验证明，AEA对体外培养的牛眼小梁细胞的fibronectin介导的迁移有较为明显的抑制作用，且在其一定的浓度范围内，呈浓度依赖性关系。同时，fibronectin也参与小梁细胞之间以及小梁细胞与细胞基质之间的相互作用。有研究表明，青光眼患者的房水中存在fibronectin堆积现象［8,10,11］，这说明fibronectin可能参与了房水流出的调节过程。本试验证明，AEA对体外培养的牛眼小梁细胞的fibronectin介导的粘附功能有较明显的抑制作用，并在一定的浓度范围内，呈浓度依赖性关系。基于以上试验结果以及相关的研究成果，我们可以得出以下结论；内源性大麻素物质之所以能降低眼压，可能是通过改变小梁细胞的一些功能状态，如增殖、黏附和迁移等，间接调节房水的流出状态来实现的。因为小梁细胞的增生或细胞数量减少均可导致POAG的发生,所以我们还认为，AEA对眼内压的作用机制是极其复杂的,可能是双向的。一方面，AEA对小梁细胞的增殖的抑制作用提示，当POAG的发生是由于小梁细胞的增生而引起时,AEA对小梁细胞的增殖的抑制作用可能导致眼内压的降低,但另一方面,当POAG的发生是由于小梁细胞的减少而引起时,其对小梁细胞的迁移和黏附功能的抑制作用又提示，其可能同时参与了青光眼的发生及发展的过程。也就是说,AEA可通过抑制小梁细胞的增殖而参与了POAG的发病。我们的研究还表明，AEA其降眼压的功能是在一定浓度范围内发挥的，一旦超过这个临界点，其作用可能会适得其反。

　　表1AEA对牛眼小梁细胞增殖功能的影响（略）

　　表2对牛眼小梁细胞粘附功能的影响（略）

　　表3AEA对牛眼小梁细胞迁移功能的影响（略）

　　研究证实,内源性大麻素可以激活CB1、CB2受体以及其它G蛋白偶联受体和各种离子通道［12］。AEA与CB1受体的亲和力要大于CB2受体［13］。Stamer等［14］在牛及人眼的睫状突和小梁网中证实了CB1mRNA及其蛋白的存在。对眼内压有影响的睫状突与小梁网均存在CB1受体，这就说明AEA对房水循环的影响不仅局限于小梁网，同时，对房水的生成可能也具有一定的调节作用。AEA影响眼压可能还有多种作用方式，需要我们进一步深入进行研究和揭示。从而为大麻素的临床应用提供可靠的理论根据，指导临床工作的开展。

　　【参考文献】

　　1 Kumar A, Song ZH. CB1 cannabinoid receptormediated changes of trabecularmeshwork cellular properties. Mol Vis2006;12:290297

　　2 杨新光,李美玉.牛眼小梁细胞体外培养及吞噬功能的研究.中华眼科杂志1996;32(2):136139

　　3 吴琼,张德秀,李琛,等.肿瘤坏死因子α对体外培养的牛眼小梁细胞MMP3, MMP9和TIMP2表达的影响.国际眼科杂志 2006;6(2):328331

　　4 李美玉.青光眼学.北京:人民卫生出版社 2004:5051,68

　　5 Rohen JW, LutjenDrecoll E. Biology of the trabecular meshwork. In : LutjenDrecoll E,ed. Basic aspects of glaucoma research. New York : schattaccer2 stuttgart 1986:141166

　　6 Wordinger RJ, Clark AF, Agarwal R, et al. Cultured human trabecular meshwork cells express functional growth factor receptors. Invest Ophthalmol Vis Sci1998;39:1575

　　7 Hogg P, Calthorpe M, Ward S, et al. Migration of culturedbovine trabecular meshwork cells to aqueous humor and constituents. Invest Ophthalmol Vis Sci1995;36:24492460

　　8 Hogg P, Calthorpe M, Batterbury M, et al. Aqueous humorstimulates the migration of human trabecular meshwork cells in vitro. Invest Ophthalmol Vis Sci2000;41:10911098

　　9 曹阳,魏厚仁,笪邦红.转化生长因子β2对牛眼小梁细胞吞噬功能的影响.同济医科大学学报 2001;12：559561

　　10 Clark AF, Wilson K, de Kater AW, et al. Dexamethasone induced ocularhypertension in perfusion cultured human eyes. Invest Ophthalmol Vis Sci1995;36:478 489

　　11 Steely HT, Browder SL, Julian MB, et al. The effects of dexamethasone on fibronectin expressionin cultured human trabecular meshwork cells. Invest Ophthalmol Vis Sci1992;33:22422250

　　12 Waku K. Endogenous cannabinoid receptor ligandsanandamide and 2arachidonoylglycerol. Yakugaku Zasshi2006;126(2):6781

　　13 Chen J，Matias I，Dinh T， et al. Finding of endocannabinoids in human eye tissues: Implications for glaucoma. Biochem Biophys Res Commun2005;330:10621067

　　14 Stamer WD, Golightly SF, Hosohata Y, et al. Cannabinoid CB receptor expression, activation and detection of endogenous ligand in trabecular meshwork and ciliary process tissues. Eur J Pharmacol2001;431:277286